利用CRISPR/Cas9系统构建H22细胞GP73基因敲除稳定株及功能鉴定

发布时间：2021-11-18 01:00

　　目的利用CRISPR/Cas9基因编辑系统敲除小鼠源肝癌细胞H22中的GP73基因,构建H22细胞GP73基因敲除的稳定细胞株。方法根据CRISPR/Cas9靶点设计原则,设计2条特异性识别GP73基因启动子的上下游sgRNA,利用载体p X459质粒,构建2对重组真核表达质粒。经酶切和测序鉴定后,将重组质粒转染至H22细胞内,使用嘌罗霉素加压筛选稳定敲除GP73的H22细胞株,利用免疫印迹检测重组质粒对内源GP73的敲除效果。MTT实验检测GP73被敲除后对细胞增殖能力的影响,再利用划痕实验检测细胞的迁移能力。结果免疫印迹结果说明敲除GP73基因的小鼠源H22细胞株内无GP73蛋白的表达;并且GP73被敲除后,H22细胞的增殖能力和迁移能力减慢。结论通过CRISPR/Cas9系统获得了靶向GP73基因的重组质粒,并且筛选出了稳定干扰GP73表达的细胞株,从而为探讨GP73在肝癌发生中的作用奠定基础。 

【文章来源】：军事医学. 2016,40(07)北大核心CSCD

【文章页数】：5 页

【文章目录】：
1 材料与方法
    1.1 材料
    1.2 方法
        1.2.1 sgRNA靶点的选择及寡核苷酸链设计
        1.2.2 重组真核表达质粒p X459-sgRNA构建
        1.2.3 H22细胞的培养与转染
        1.2.4 H22细胞GP73基因敲除稳定细胞株的单克隆筛选
        1.2.5 提取细胞基因组DNA及测序结果
        1.2.6 H22细胞GP73基因敲除稳定细胞株免疫印迹检测
        1.2.7 细胞划痕实验
        1.2.8 MTT细胞增殖实验
    1.3 统计学分析
2 结果
    2.1 p X459-sgRNA载体的构建
    2.2 重组真核表达质粒p X459-sgRNA的测序结果
    2.3 免疫印迹检测H22细胞GP73基因敲除细胞株内GP73蛋白的表达及测序确定突变位点
    2.4 H22/GP73-KO细胞的迁移能力检测
    2.5 H22/GP73-KO细胞的增殖速度检测
3 讨论



本文编号：3501907