基于恒温扩增原理建立丙型肝炎病毒基因分型的方法

发布时间：2021-11-23 11:08

　　[目的]采用环介导恒温扩增和解螺旋酶依赖的恒温扩增方法建立丙型肝炎病毒（hepatitis C virus,HCV）基因分型的方法。[方法]1.建立HCV的恒温扩增反应体系。基于环介导恒温扩增（LAMP）的原理,针对丙型肝炎病毒HCV-1b,2a,3和6a基因型设计每种亚型的引物。基于解螺旋酶恒温扩增（HDA）的原理,设计一对通用引物以扩增HCV-1b,3a和3b,另设计一对通用引物扩增HCV-2a和6a,在两个体系中分别设计各亚型的探针对HCV进行基因分型。2.依据HCV全基因的5,UTR～Core区中各基因型特异的基因序列,用Primer Explorer V.4软件设计1 b,2a,3和6a型对应的引物用于LAMP扩增,优化LAMP反应体系。设计HCV-1/3引物和2/6引物用于HDA扩增,每个体系设计对应型别Taqman探针用于基因分型。3.LAMP法扩增HCV的性能评价。将所设计的引物与对应的模板反应,确定所设计的HCV各基因型的引物特异性。对不同型别的阳性标本倍比稀释,稀释后的不同浓度的样本平均分成10份分别提取RNA,加入对应的特异性的引物,以10个样本全部检测为阳性的最... 

【文章来源】：昆明医科大学云南省

【文章页数】：80 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

图２：?ＬＡＭＰ体系中引物与对应的模板反应，ＮＣ表示去离子水作为模板的阴性??

图２：?ＬＡＭＰ体系中引物与对应的模板反应，ＮＣ表示去离子水作为模板的阴性??对照。??１．２?ＬＡＭＰ体系的最佳反应温度和时间。??１．２．１?ＬＡＭＰ扩增温度的优化??将ＨＣＶ－ｌｂ，２ａ，３ａ，３ｂ和６ａ引物与对应的模板进行反应，分别将ＬＡＭＰ反应??温度设为５８。０：，６３。０：，６５１：，反应６〇１１１丨１１。当温度为６５°０时＾１０／－１１３，２３，３＆，３１），６３全??部为阳性（图３），由此，后续实验以６５°Ｃ为ＬＡＭＰ反应体系的最佳反应温度。??ａＮＣ??

设置４０，５０，６０ｍｉｎ三个时间梯度分别对ＨＣＶ－ｌｂ，２ａ，３，６ａ四种基因型模板和引??物进行检测，结果显示ＨＣＶ－ｌｂ，２ａ反应管在４０ｍｉｎ下显示较弱的阳性，５０，６０ｍｉｎ??后全为阳性（图４－Ａ，Ｂ）；?ＨＣＶ－３，６ａ４０ｍｉｎ时为阴性，在５０，６０ｍｉｎ后全为阳性，??（图４－Ｃ，Ｄ）。四个亚型在６０ｍｉｎ后反应管无为阳性反应，后续实验中我们选择??６０ｍｉｎ作为最佳反应时间。??ＨＣＶ－ｌｂ?ＨＣＶ－２ａ?ＨＣＶ－３?ＨＣＶ－６ａ??Ａ?Ｍ?４０?５０?６０?ＮＣ?４０?５０?６０?ｍｉｎ?＾?Ｍ?４０?５０?６０?ＮＣ＇?４０?５０?６０?ｍｉｎ??Ｂ棚ｎ??１?°。??Ｂ?Ｉ?ＩＣＹ－ｌｂ?ＴＩＣＶ－２ａ?Ｄ?ＨＣＶ－３?ＨＣＶ－６ａ??４０?５０?６０?４０?５０?６０?ｍｉｎ?ＮＣ?４０?５０?６０?４０?５０?６０?ｍｉｎ?ＮＣ??图４．?ＬＡＭＰ体系的时间优化。Ａ：ＨＣＶ－ｌｂ，２ａ的ＬＡＭＰ反应产物的电泳图，ＮＣ表??示阴性对照。Ｂ丄ＡＭＰ体系在４０ｍｉｎ，５０ｍｉｎ，６０ｍｉｎ条件下的ＨＣＶ－ｌｂ，２ａ反应结果??图。Ｃ．ＨＣＶ－３，６ａ的ＬＡＭＰ反应产物的电泳图。Ｄ．ＨＣＶ－３，６ａ在ＬＡＭＰ反应下??４０ｍｉｎ，５０ｍｉｎ，６０ｍｉｎ?的结果图。??２．?ＬＡＭＰ法的特异性评价??ＨＣＶ－ｌｂ，２ａ，３，６ａ的引物只与对应的模板反应呈黄色，与其他模板反应为红??色。同时，ＨＣＶ－３型的引物可以同时与模板ＨＣＶ－３ａ，３ｂ反应，反应管均为黄色。??ｔｅｍｐｌａｔｅ??Ａ?Ｉ?２?３?４?ＮＣ?１３?１?２?３?４?５?ＮＣ??；?——＂Ｔ

【参考文献】：
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本文编号：3513756