酸性果胶裂解酶的基因筛选及其在黑曲霉中高效重组表达研究

发布时间：2021-11-23 19:25

　　酸性果胶裂解酶可通过β-消除反应有效降解果胶类物质,在食品工业中具有广泛用途,尤其是果蔬汁加工业,有助于果蔬汁澄清和提高出汁率。酸性果胶裂解酶主要由真菌产生,尤其是黑曲霉,但其天然原始菌株普遍存在产酶量低和产物杂质多的问题,远达不到工业需求。本研究旨在以具有低蛋白背景的安全菌株黑曲霉SH-2为表达宿主,将来自黑曲霉全基因组的5个果胶裂解酶基因（pelA、pelB、pelC、pelD、pelF）分别进行过量表达以期实现酸性果胶裂解酶的高效重组表达,并对重组酶的酶学性质和其在果汁澄清方面的实际应用进行探究。主要研究内容如下:（1）将构成黑曲霉果胶裂解酶基因家族的5个果胶裂解酶基因（pelA、pelB、pelC、pelD和pelF）成功克隆,并利用黑曲霉自身强启动子（葡萄糖淀粉酶启动子,PglaA）分别实现5个果胶裂解酶基因在黑曲霉SH-2中进行重组过量表达。通过酶活测定成功筛选得到两个高表达的酸性果胶裂解酶基因pelA和pelD,转化菌株分别为SH2-PelA和SH2-PelD,在摇瓶发酵条件下最高酶活力分别为11069.2 U/mL和8822.6 U/mL,在液体深层发酵条件下最高酶活力... 

【文章来源】：华南理工大学广东省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

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【学位级别】：硕士

【部分图文】：

果胶结构简图

图 1-2 果胶裂解酶作用机制Fig 1-2 The mechanism of action of pectin lyase不同基因来源的果胶裂解酶具有不同的理化性质，部分果胶裂解酶的理化1-1 所示。总的说来，果胶裂解酶的蛋白分子量 Mw通常在 30-50 KDa 之间，于真菌的果胶裂解酶其最适反应 pH 为酸性，pH 值大多数在 3-5 范围之间，并件下比较稳定，但也有存在少数真菌来源的果胶裂解酶在碱性条件下比较稳定来源的果胶裂解酶的最适反应 pH 通常偏碱性，大都在 pH 值 8-10 的范围之间分的果胶裂解酶为中温酶，最适反应温度在 40 ℃到 50 ℃之间。目前也有少数文从一些嗜热菌中分离得到了少数可耐高温的果胶裂解酶基因。由于米氏常数 K因素的影响，如底物类型、测定温度、测定 pH 以及离子强度等，故不同来源解酶的 Km值数据差异较大，可比性不强。总的说来，改善果胶裂解酶对酶极件的适应性是目前的研究热点之一。表 1-1 部分果胶裂解酶的理化性质

华南理工大学硕士学位论文A235为样品吸光值变化，由测量组的吸光值减去相应对照组的吸光值得ol；N为发酵上清液样品的稀释倍数；反应时间为10 min；反应体系为1.5数为5倍；添加酶量为0.25 mL。含量的测定及 SDS-PAGE 蛋白电泳 法测定果胶裂解酶蛋白浓度CA Protein Assay 试剂盒测定果胶裂解酶过量表达株发酵上清液中的胞作步骤详见试剂盒操作说明书。牛血清（BSA）蛋白浓度标准曲线如相关性良好。


本文编号：3514506