运用CRISPR/Cas9技术构建FosB基因敲除小鼠模型与对Plcg2（缺失外显子20-22）小鼠的初步研究

发布时间：2021-11-26 05:52

　　家族寒冷性荨麻疹中有一种家族患病与人类16号染色体上磷脂酶Cγ2（phospholipase C gamma 2,Plcg2）基因缺失20至22号外显子密切相关,这种缺失引发了多个白细胞亚群中信号传导异常,导致了机体免疫紊乱表型的出现。为了进一步探究Plcg2介导相关细胞亚群的信号转导异常的具体机制,本课题对已构建的Plcg2基因缺失20-22号外显子模型小鼠的相关免疫细胞百分比及钙离子通量变化情况进行检测分析,确定该模型小鼠对下一步机制研究的可靠性。同时,Plcg2基因的研究中发现通过细胞RNA测序发现FosB基因在生发中心B细胞相比于初始B细胞存在着高表达现象,为了进一步探究该基因对外周淋巴细胞的具体功能和作用机制,课题计划构建FosB基因敲除小鼠模型从而为深入探究相关功能和机制提供可靠的实验对象。新一代基因编辑技术CRISPR/Cas9是一种简便快捷的基因编辑工具,它的开发应用极大地方便了生物科学研究。本研究通过CRISPR/Cas9技术平台,使用sgRNA和Cas9蛋白对小鼠胚胎进行显微注射来获得FosB基因敲除小鼠模型。运用流式细胞术对Plcg2（exon20-22）小鼠检测... 

【文章来源】：福建师范大学福建省

【文章页数】：85 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

FosB基因敲除策略

福建师范大学李奎硕士学位论文-28-图1-1FosB基因敲除策略Fig1-1FosBgeneknockoutstrategy3.2敲除载体的鉴定将目的基因FosB的四个不同sgRNA与酶切后的PX459连接得到重组质粒，重组质粒经转化涂板过夜培养后挑取白色单克隆菌落，用sgRNA转录模板的引物对该菌落先进行菌落PCR鉴定，再对能扩增出目的条带的单克隆菌落进行质粒提取，然后送去测序公司测序。经由Bioedit软件对测序结果与sgRNA序列进行比对，比对结果显示四个sgRNA分别与PX459载体连接成功，说明四个敲除载体已成功构建。图1-2PX459-FosB-sRNA敲除质粒鉴定Fig1-2TheIdentificationoftheknockoutplasmidPX459-FosB-sgRNA

第一章应用CRISPR/Cas9技术建立FosB基因敲除小鼠模型-29-3.3细胞转染效率实验中，我们将L929细胞接种于六孔板中，设置重复的实验组和对照组，对照组中除了空白对照以外，还有用于观察转染效率的GFP质粒对照组。L929细胞经转染24小时后即可在倒置荧光相差显微镜下面通过GFP的表达情况来观察细胞的转染效率，经过流式分析后发现转染效率约为30%。图1-3通过GFP表达观察L929细胞转染效率（10X）Fig1-3.ObservationoftransfectionefficiencyofL929cellsbyGFPexpressionGFP：在激发光下观察绿色荧光蛋白表达情况荧光蛋白表达；BF：明场中同一视野下的细胞生长情况，比例尺为100um3.4对转染敲除质粒的L929细胞PCR鉴定和T7E1酶切结果转染细胞经过药物筛选后重新长满六孔板时，取出实验组部分细胞提取基因组DNA，经PCR及测序验证和T7E1体外酶切验证；结果显示在设计的四个sgRNA敲除质粒转染实验组中，仅在sg4实验组的测序结果中出现了套峰的现象（图1-3）；且仅有sg4实验组的转染细胞基因组目的片段经T7E1体外酶切后出现两条被切割后条带，且条带大小分别约为443bp与300bp（图1-4）。实验发现测序以及T7E1


本文编号：3519526