水稻抽穗期基因OsDof6功能的初步研究

发布时间：2022-01-08 22:58

　　【目的】以前期通过穗发育芯片筛选到一个水稻Dof家族转录因子Os Dof6为研究对象,进一步探究Os Dof6的表达模式与生物学功能。【方法】对Os Dof6的基因、蛋白及启动子序列进行生物信息学分析,利用CRISPR/Cas9技术对该基因进行定点编辑,通过实时定量PCR和亚细胞定位技术分析该基因的表达模式。【结果】对该基因的启动子序列分析表明,该基因启动子中存在大量与光响应、激素响应及胁迫响应相关的顺式调控元件。利用CRISPR/Cas9技术获得了2种不同突变类型的功能缺失突变体9522Dof6-3和9522Dof6-4。对突变体T1株系进行表型观察发现,相较于对照,两种突变体在营养生长阶段分蘖数明显降低,转入生殖生长阶段后,两种突变体的抽穗时间推迟约3d。实时定量PCR结果显示Os Dof6在水稻根、茎、叶和穗中均有不同程度的表达,在穗发育后期相对表达量明显提高;通过亚细胞定位分析发现OsDof6定位于细胞核。【结论】初步判断Os Dof6基因会影响水稻分蘖数与抽穗期。 

【文章来源】：中国水稻科学. 2020,34(05)北大核心CSCD

【文章页数】：9 页

【部分图文】：

Os Dof6基因时空表达分析

图2 Os Dof6基因时空表达分析通过同源重组的方式，将Os Dof6的c DNA序列（不包含终止密码子TAA）整合到pCAMBIA1305-GFP载体上，获得pCAMBIA1305-Dof6-GFP植物融合表达载体，将植物表达载体转入农杆菌并侵染烟草叶片表皮细胞，通过激光共聚焦显微镜观察Dof6-GFP融合蛋白的荧光信号（图3),Dof6-GFP融合蛋白主要定位在细胞核中，而在空载对照的细胞膜、细胞质和细胞核中均能检测到荧光信号。该实验结果表明，Os Dof6特异定位于细胞核中。

为了进一步研究Os Dof6在水稻生长发育中的功能，构建了Os Dof6基因编辑载体。经过PCR鉴定与序列比对，OsDof6的靶位点成功构建入pYLCRISPR/Cas9-MT载体中，获得了植物表达载体p YLCRISPR/Cas9-MT-Dof6（图4-A）。将该植物表达载体转入农杆菌菌株，通过农杆菌介导转化水稻9522愈伤组织并鉴定，共获得4株阳性转基因植株9522Dof6-1、9522Dof6-2、9522Dof6-3和9522Dof6-4，其中9522Dof6-2、9522Dof6-3和9522Dof6-4在靶位点处出现突变，9522Dof6-1未发生突变。9522Dof6-2和9522Dof6-3具有相同的突变类型，该突变使得原基因序列的第62～69 bp共8个碱基缺失，直接导致阅读框移码致使翻译提前终止，破坏了Dof蛋白的结构，形成了一个与Dof蛋白完全不同的108 aa的蛋白（图4-D）。9522Dof6-4使得原基因序列第11～313 bp共303个碱基丢失，即氨基酸序列第4～104 aa共100个氨基酸缺失，该突变使Dof保守结构域完全缺失。图5 野生型9522与Dof6突变体的表型比较

【参考文献】：
期刊论文
[1]水稻光温敏核不育系‘亮S’异交特性研究[J]. 赵金成,裘烨,陈光辉,朱旭东.  作物研究. 2016(05)
[2]水稻Dof转录因子家族的鉴定与生物信息学分析[J]. 纪剑辉,周颖君,杨雯,谢晶,华慧,杨立明.  江苏农业学报. 2015(06)
[3]水稻Dof基因家族的组织表达谱及胁迫诱导表达特征分析[J]. 周淑芬,颜静宛,刘华清,林智敏,陈睿,杨绍华,王锋.  分子植物育种. 2012(06)

硕士论文
[1]基于CRISPR/Cas9技术的水稻OsD1基因的敲除及其功能初步探究[D]. 邓尧.湖南农业大学 2018



本文编号：3577437