豆状带绦虫胰岛素样生长因子受体基因的克隆表达及互作蛋白鉴定

发布时间：2017-05-12 10:12

  本文关键词：豆状带绦虫胰岛素样生长因子受体基因的克隆表达及互作蛋白鉴定，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：豆状带绦虫是一种重要的寄生蠕虫,其幼虫引起的豆状囊尾蚴病对养兔业危害严重。胰岛素样生长因子受体(IGFR)作为一种重要的多功能细胞调控因子,在动物机体的细胞增殖、生长及维持正常代谢等方面发挥重要作用,可作为潜在的药物靶标和疫苗候选分子。本研究对豆状带绦虫胰岛素样生长因子受体(Tp IGFR)基因进行了克隆表达及互作蛋白鉴定。主要取得以下结果:1.豆状带绦虫胰岛素样生长因子受体(Tp IGFR)基因的克隆与序列分析。用RT-PCR和cDNA末端快速扩增(RACE)克隆Tp IGFR基因全长c DNA序列,进行生物信息学分析。结果:Tp IGFR cDNA全长5 154 bp,包含一个完整的ORF,大小约4 953 bp,编码1 651个氨基酸,理论分子质量约为181.92 ku。蛋白结构预测表明,TpIGFR蛋白由胞外配体结合区(LD)、跨膜区(TM)和酪氨酸蛋白激酶区(TK)组成,具有IGFR的特征结构域。用Mega 5.0软件绘制系统进化树,Tp IGFR与猪带绦虫胰岛素样生长因子受体均处于同一进化分支。2.Tp IGFR胞外配体结合区(Tp IGFR-LD)的原核表达及组织定位。构建原核表达载体pET30a-TpIGFR-LD,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳分析,重组蛋白Tp IGFR-LD以包涵体形式表达,分子量大小约51.48 ku。Western blot分析表明,重组蛋白能被兔豆状囊尾蚴感染血清及抗His抗体特异识别,具有良好的反应原性。镍琼脂糖凝胶纯化蛋白Tp IGFR-LD,用弗氏佐剂乳化后、多点注射免疫家兔,免疫4次,用间接ELISA法检测,效价达1:2.56×104。免疫组化结果表明,Tp IGFR-LD主要表达于成虫的体壁及卵巢,预测Tp IGFR可能与虫体摄取营养及生殖发育有关。3.Tp IGFR-LD和豆状带绦虫胰岛素样多肽(TpI)的真核表达。构建真核表达载体pCMV-HA-Tp IGFR-LD和pCMV-myc-TpI,共转染CHO细胞。间接免疫荧光分析表明,Tp IGFR-LD和Tp I均在真核细胞中成功表达。4.Tp IGFR-LD和TpI蛋白相互作用。免疫荧光共聚焦试验表明,发红色荧光的pCMV-HA-Tp IGFR-LD可与发绿色荧光的p CMV-myc-Tp I共表达呈黄色荧光。免疫共沉淀(Co-IP)证实Tp IGFR-LD和Tp I均具有生物学活性,Tp IGFR-LD可识别Tp I,存在相互作用。
【关键词】：豆状带绦虫 TpIGFR-LD 原核表达 组织定位 真核表达 免疫共沉淀
【学位授予单位】：甘肃农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.7
【目录】：

• 摘要2-3
• SUMMARY3-5
• 英文缩略语表5-8
• 第一章 文献综述8-14
• 1.豆状带绦虫概述8-10
• 1.1 豆状带绦虫及生活史8
• 1.2 豆状囊尾蚴病8-9
• 1.3 豆状带绦虫病的免疫诊断9
• 1.4 豆状带绦虫病的治疗与防治9-10
• 2.胰岛素样生长因子受体概述10-13
• 2.1 胰岛素样生长因子受体及其分类10
• 2.2 胰岛素样生长因子受体的结构10-11
• 2.3 胰岛素样生长因子受体的生物学功能11-12
• 2.4 抑制剂12-13
• 3.研究目的与意义13-14
• 第二章 TPIGFR基因的克隆与序列分析14-25
• 1.材料与方法14-18
• 1.1 虫体、菌株及试剂14
• 1.2 主要仪器14-15
• 1.3 总RNA的提取15-16
• 1.4 cDNA合成16
• 1.5 TpIGF基因的扩增16-17
• 1.6 琼脂糖凝胶电泳检测17
• 1.7 克隆载体的鉴定TpIGF基因序列分析17-18
• 1.8 TpIGF基因序列分析18
• 2.结果18-23
• 2.1 总RNA的提取18
• 2.2 TpIGF基因的克隆18
• 2.3 TpIGF基因的序列分析18-23
• 2.3.1 TpIGF的理化性质18-19
• 2.3.2 TpIGF系统进化分析19-20
• 2.3.3 TpIGF二级结构分析20-22
• 2.3.4 TpIGF结构域分析22
• 2.3.5 TpIGF三维结构预测22-23
• 3.讨论23-25
• 第三章 TPIGFR-LD的原核表达及组织定位研究25-34
• 1.材料与方法25-28
• 1.1 载体与实验动物25
• 1.2 主要试剂25
• 1.3 主要仪器25
• 1.4 构建TpIGFR-LD重组质粒25-27
• 1.5 TpIGFR-LD的表达及Western-blotting27
• 1.6 重组蛋白的免疫组化27-28
• 1.6.1 制备抗体27
• 1.6.2 测定血清效价27-28
• 1.6.3 检测抗体特异性28
• 1.6.4 TpIGFR-LD组织定位28
• 2.结果28-32
• 2.1 TpIGFR-LD基因的扩增28-29
• 2.2 双酶切鉴定重组质粒29
• 2.3 TpIGFR-LD的表达Western blotting29-31
• 2.4 血清效价测定31
• 2.5 抗体的特异性检测31-32
• 2.6 TpIGFR-LD的定位分布32
• 3.讨论32-34
• 第四章 TPIGFR-LD的真核表达及蛋白互作34-43
• 1. 材料与方法34-38
• 1.1 载体和细胞34
• 1.2 主要试剂34
• 1.3 主要仪器34-35
• 1.4 重组质粒的构建35-37
• 1.5 重组质粒转染CHO细胞系的建立37-38
• 1.5.1 重组质粒转染CHO细胞37
• 1.5.2 间接荧光免疫实验37-38
• 1.6 重组蛋白的相互作用实验38
• 2. 结果38-41
• 2.1 重组质粒的双酶切鉴定38-39
• 2.2 重组质粒间接荧光免疫鉴定39-40
• 2.3 重组蛋白共聚焦鉴定40
• 2.4 重组蛋白Co-IP鉴定40-41
• 3. 讨论41-43
• 第五章 全文结论43-44
• 参考文献44-48
• 致谢48-49
• 作者简介49-50
• 导师简介50-52

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