大叶落地生根KdSAHH基因功能鉴定

发布时间：2017-05-12 20:13

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【摘要】：S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶(S-adenosyl-L-homocysteine hydrolase, SAHH)广泛存在于生物体内,是已知的唯一能够水解S-腺苷-L-高半胱氨酸(S-adenosyl-L-homocysteine, SAH)成半胱氨酸(Hcy)和腺苷(Ado)的酶。SAH作为转甲基反应的抑制剂,与S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine, SAM,体内甲基供体)的比值常用来作为衡量植物整体甲基化水平的重要指标。在该研究中,根据已知的大叶落地生根(Kalanchoe daigremontiana) KdSAHH基因序列(GenBank登录号：KF953475),对该基因进行亚细胞定位分析、干旱表达分析以及烟草转化,以初步鉴定KdSAHH基因的功能,为后续全面深入研究该基因提供一定的借鉴与参考。通过研究,得到如下结论：1.构建了亚细胞定位表达载体3302Y-KdSAHH,利用瞬时转化法注射健康生长三周大小的本生烟草叶片,暗培养48 h后在激光共聚焦显微镜下观察蛋白的表达情况,结果显示,黄色荧光在细胞质与细胞核中均有分布,表明大叶落地生根SAHH蛋白定位于细胞质与细胞核。2.对健康生长的大叶落地生根植株进行自然干旱处理,分别在土壤相对含水量达到20%、10%、3%时的三个时间点取样,通过半定量RT-PCR分析KdSAHH基因的表达模式,结果显示,随着干旱胁迫程度的加重,KdSAHH的表达量逐渐升高,表明该基因与抗旱性相关。3.构建了植物超表达载体pZH01-KdSAHH,利用农杆菌介导的叶盘法转化野生型烟草W38,经过诱芽、生根得到烟草再生植株,对再生烟草分别进行载体HPT基因片段及目的基因KdSAHH的阳性检测,结果显示共获得9株阳性植株。4.用20%的PEG6000对转KdSAHH烟草和野生型烟草进行模拟干旱处理,分别在0h,12h和24 h取样,测定相关生理指标。结果显示,在PEG6000处理的24 h,两种烟草均表现出了明显的失水症状,转KdSAHH烟草萎蔫程度较轻,上端仍有部分叶片保持挺立,而野生型烟草所有叶片均表现出明显的失水症状。与野生型烟草相比,转基因烟草叶片RWC与Chl含量下降程度较轻,两种烟草的叶片RWC在24 h差异显著(P0.05),Chl含量在12与24h均差异显著(P0.05),表明在干旱胁迫下,转基因烟草能够保持相对稳定的代谢。两种烟草在干旱胁迫下产生的MDA含量均有所增加,相比之下,野生型烟草的上升程度较大,在24 h两者差异显著(P0.05),表明转基因烟草膜脂过氧化程度较轻,受伤害小。两种烟草的SOD含量与POD含量均呈明显的上升趋势,相比之下,野生型烟草产生了更多的SOD和POD。两者的POD含量在12与24 h差异显著(P0.05),SOD含量则无明显差异。分析可能是因为转基因烟草抗旱性增强,故而未产生较多的活性氧。
【关键词】：大叶落地生根 KdSAHH 亚细胞定位 表达分析 干旱胁迫
【学位授予单位】：北京林业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q943.2
【目录】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-10
• 缩写词10-12
• 1 引言12-24
• 1.1 S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶基因13-16
• 1.1.1 DNA甲基化与表观遗传13-14
• 1.1.2 SAHH的研究概况14-16
• 1.2 大叶落地生根简介16-18
• 1.2.1 大叶落地生根的观赏价值16
• 1.2.2 大叶落地生根的药用价值16-17
• 1.2.3 景天酸代谢模型17
• 1.2.4 胎生繁殖植物模型17-18
• 1.3 转基因技术18-19
• 1.3.1 转基因技术简介18
• 1.3.2 常见转基因方法18-19
• 1.4 植物抗旱生理19-22
• 1.4.1 干旱对植物生长的影响20
• 1.4.2 抗旱相关生理生化指标20-22
• 1.4.2.1 干旱胁迫对相对含水量、叶水势的影响20
• 1.4.2.2 干旱胁迫对活性氧代谢的影响20-21
• 1.4.2.3 干旱胁迫对丙二醛代谢的影响21
• 1.4.2.4 干旱胁迫对光合作用的影响21-22
• 1.5 研究目的、内容与技术路线22-24
• 1.5.1 研究目的22
• 1.5.2 研究内容22-23
• 1.5.3 技术路线23-24
• 2 材料与方法24-33
• 2.1 试验材料24-25
• 2.1.1 植物材料24
• 2.1.2 生化试剂24
• 2.1.3 主要仪器设备24
• 2.1.4 培养基的配制24-25
• 2.2 亚细胞定位25-27
• 2.2.1 引物设计25
• 2.2.2 亚细胞定位载体3302Y-KDSAHH构建25-26
• 2.2.3 EHA105农杆菌感受态制备26-27
• 2.2.4 转化农杆菌感受态27
• 2.2.5 本生烟草瞬时表达27
• 2.3 干旱胁迫下KDSAHH的表达分析27-29
• 2.3.1 大叶落地生根自然干旱处理27
• 2.3.2 大叶落地生根cDNA的合成27-28
• 2.3.3 引物设计28
• 2.3.4 半定量RT-PCR28-29
• 2.4 烟草转化29-31
• 2.4.1 植物表达载体PZH01-KDSAHH构建29
• 2.4.2 烟草无菌苗种植29
• 2.4.3 烟草叶盘法转化29-30
• 2.4.4 再生植株阳性检测30-31
• 2.5 转基因烟草植株干旱胁迫下生理指标测定31-33
• 2.5.1 叶片相对含水量31-32
• 2.5.2 叶绿素含量32
• 2.5.3 丙二醛含量32
• 2.5.4 过氧化物酶含量32-33
• 3 结果与分析33-43
• 3.1 KDSAHH的亚细胞定位33-34
• 3.1.1 KDSAHH的亚细胞定位结果33-34
• 3.1.2 小结34
• 3.2 干旱胁迫下KDSAHH的表达分析34-36
• 3.2.1 干旱胁迫下KDSAHH的表达34-35
• 3.2.2 小结35-36
• 3.3 植物表达载体PZH01-KDSAHH的构建及烟草转化36-39
• 3.3.1 植物表达载体PZH01-KDSAHH的构建36
• 3.3.2 烟草转化36-37
• 3.3.3 再生植株阳性检测37-38
• 3.3.4 小结38-39
• 3.4 干旱胁迫下的生理指标分析39-43
• 3.4.1 干旱胁迫下的生理表现39
• 3.4.2 干旱胁迫下的生理指标39-41
• 3.4.3 小结41-43
• 4 总结与展望43-45
• 4.1 总结43
• 4.2 展望43-45
• 参考文献45-51
• 个人简介51-53
• 导师简介53-55
• 致谢55

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