小菜蛾RNAi通路核心元件的基因组筛选及PxDcr-2基因的功能验证

发布时间：2017-05-13 02:12

  本文关键词：小菜蛾RNAi通路核心元件的基因组筛选及PxDcr-2基因的功能验证，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：RNA干扰(RNA interference, RANi)是由双链RNA (double-stranded RNA, dsRNA)引发,使得mRNA降解或翻译被抑制的现象,在真核生物中高度保守。根据生物学机制和所结合Argonaute (Ago)蛋白的不同,RNAi在生物体内存在三条通路：小干扰RNA (small interfering RNA, siRNA)、小RNA(microRNA, miRNA)和PIWI互作RNA (PIWI-interacting RNA, piRNA)。虽然RNAi通路的核心元件在大多数生物中是保守的,但昆虫中它们的保守程度却不尽相同。而小菜蛾是目前全球分布的重要十字花科害虫,在虫体中能够实现RNAi。因此,我们利用小菜蛾基因组和转录组数据,依据秀丽隐杆线虫、果蝇、赤拟谷盗和家蚕的相关信息,筛选出RNAi通路中的核心元件。本研究中,在小菜蛾中发现2个Dicer基因、1个Drosha、基因5个Argonaute基因、1个Pasha基因和1个Loquacious基因,但并没有发现R2D2基因。并且对这些基因在小菜蛾中不同发育阶段和组织中的表达模式通过qPCR进行了分析。作为RNAi通路中的核心元件,Dicer-1蛋白主要在miRNA通路中发挥作用,Dicer-2蛋白则是siRNA形成中至关重要的。本研究中,对小菜蛾Dicer-1 (PxDcr-1)基因CDS的全长和小菜蛾Dicer-2 (PxDcr-2)基因CDS的全长首次进行了克隆和分析,并且通过RNAi实验对PxDcr-2基因的功能进行了初步探索。PxDcr-1基因的CDS全长为8457 bp,氨基酸序列长度为2818 aa；PxDcr-2基因的CDS全长为5,091bp,氨基酸序列长度为1,696 aa。通过氨基酸序列比对和进化树分析,PxDcr-1和PxDcr-2蛋白都与鳞翅目昆虫同源性最高,特别是黑脉金斑蝶。在RNAi干扰的实验中,dsDcr-2-2对PxDcr-2的1rnRNA表达量的抑制效果最佳,但在注射dsRNA后,在生长发育过程中没有明显的表型变化。为了研究PxDcr-2在小菜蛾siRNA通路中的作用,将dsDcr-2-2和dsBursa/dsCYP同时向虫体注射,发现小菜蛾蛹的畸形率和死亡率与单独注射dsBursa/dsCYP相比,有所下降,说明PxDcr-2在小菜蛾RNAi通路中发挥了作用。
【关键词】：小菜蛾 RNAi Dicer
【学位授予单位】：福建农林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S433.4;Q78
【目录】：

• 摘要7-8
• Abstract8-10
• 1 前言10-20
• 1.1 昆虫中的RNAi通路类型11-15
• 1.1.1 siRNA通路11-12
• 1.1.2 miRNA通路12-14
• 1.1.3 piRNA通路14-15
• 1.2 Dicer蛋白的研究概况15-18
• 1.2.1 Dicer蛋白的生化特征及作用方式15-16
• 1.2.2 Dicer蛋白的研究进展16-18
• 1.3 小菜蛾体内的RNAi研究进展18-20
• 1.3.1 小菜蛾简介18
• 1.3.2 小菜蛾中的RNAi研究进展18-20
• 2 材料与方法20-31
• 2.1 实验材料20-21
• 2.1.1 供试昆虫20
• 2.1.2 主要试剂20
• 2.1.3 供试菌种20-21
• 2.1.4 主要仪器21
• 2.2 实验方法21-31
• 2.2.1 基因的筛选21
• 2.2.2 序列分析21
• 2.2.3 氨基酸序列比对及进化树构建21
• 2.2.4 小菜蛾RNA的提取21-22
• 2.2.5 cDNA的合成22-23
• 2.2.6 PCR验证基因23-25
• 2.2.7 qPCR基因表达量测定25-27
• 2.2.8 dsRNA的合成27-29
• 2.2.9 dsRNA的注射29-30
• 2.2.10 数据统计与分析30-31
• 3 结果与分析31-52
• 3.1 小菜蛾RNAi通路元件分析31-38
• 3.1.1 小菜蛾RNAi通路元件的特征31
• 3.1.2 小菜蛾RNAi通路元件蛋白结构域及同源性31-34
• 3.1.3 小菜蛾RNAi通路核心元件的表达模式分析34-38
• 3.2 小菜蛾中Dicer基因的特征与功能验证38-52
• 3.2.1 PxDcr-1和PxDcr-2的氨基酸序列比对与进化树分析38-48
• 3.2.2 PxDcr-1和PxDcr-2的保守域48
• 3.2.3 PxDcr-1和PxDcr-2的三维结构48-49
• 3.2.4 PxDcr-2的RNAi49-50
• 3.2.5 PxDcr-2对小菜蛾体内RNAi通路的影响50-52
• 4 讨论52-55
• 4.1 小菜蛾中的RNAi通路52
• 4.2 小菜蛾中RNAi通路核心元件表达模式52-53
• 4.3 PxDcr-2在RNAi通路中能够发挥作用53-55
• 参考文献55-61
• 附录161-62
• 附录262-85
• 附录385-86
• 致谢86

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