Chitinase转基因拟南芥对棉铃虫核型多角体病毒（HearNPV）增效作用研究

发布时间：2017-05-13 07:26

  本文关键词：Chitinase转基因拟南芥对棉铃虫核型多角体病毒（HearNPV）增效作用研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：棉铃虫核型多角体病毒(Hear NPV)含有的几丁质酶在昆虫液化和病毒与寄主传播水平上有着重要作用。此外,原核表达的几丁质酶还可以增强Hear NPV的感染效率和杀虫毒力。而几丁质是昆虫消化道一个重要的结构,是昆虫体内中肠中天然屏障围食膜的重要组成成分,即在昆虫自身保护其免受肠内容物的伤害中扮演重要角色。在这项研究中,以拟南芥(Arabidopsis thaliana)为植物载体,利用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的花序侵染法对拟南芥转化了Chitinase外源基因,并进行了其对棉铃虫核型多角体病毒(Helicoverpa armigera nucleopolyhedrovirus,Hear NPV)增效作用研究,取得如下结果:1、利用花序侵染法转化拟南芥,获得了6株表现型为阳性的Chitinase转基因拟南芥株系,通过PCR检测初步确定为阳性的转化拟南芥株系。2、通过RT-PCR检测,表明目的基因Chitinase在6个转基因株系A-F中都有表达,并且株系A的相对表达量最高,株系D的相对表达量最低。3、Chitinase转基因拟南芥对Hear NPV的增效作用试验表明,饲喂株系A的棉铃虫感染Hear NPV后的LT50和LT90比取食野生型拟南芥对照组分别缩短了36.17%和40.33%。饲喂株系D的棉铃虫感染Hear NPV后的LT50和LT90比对照组分别缩短了18.08%和25.14%。4、感染相同剂量的棉铃虫在取食转基因植物后病毒在细胞中DNA拷贝数显著高于取食野生型植物的棉铃虫,其中取食转基因株系A的棉铃虫感染Hear NPV后其细胞体内病毒复制能力最强也最快,其次是取食株系D的棉铃虫。5、取食转基因拟南芥的棉铃虫病毒产量明显高于取食野生型拟南芥,且取食转基因拟南芥株系A的棉铃虫病毒产量明显高于取食转基因株系D的棉铃虫。6、感染HearNPV的棉铃虫无论取食野生型拟南芥、株系A或株系D,其日均虫重均无显著性差异;单取食转基因和野生型拟南芥未感染病毒的棉铃虫日累积增重没有显著差异,说明转基因植物单独饲喂对棉铃虫不会有很大影响。结果表明,Chitinase转基因拟南芥在饲喂同时感染Hear NPV的棉铃虫时有利用病毒粒子更快更多的进入昆虫中肠细胞,且有助于病毒Hear NPV在棉铃虫体内的增值,以及提高病毒对棉铃虫的杀虫速度和杀虫效率。
【关键词】：拟南芥 Chitinase 转基因植物 HearNPV 棉铃虫 增效
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S476.13
【目录】：

• 摘要5-6
• ABSTRACT6-11
• 第一章 文献综述11-18
• 1.1 拟南芥转基因简介11-14
• 1.1.1 拟南芥（Arabidopsis thaliana）11-12
• 1.1.2 拟南芥浸花转化法12-14
• 1.2 杆状病毒简介及其应用研究进展14-15
• 1.2.1 杆状病毒14
• 1.2.2 杆状病毒在生物防治中的应用及其特点14-15
• 1.2.3 杆状病毒生物增效途径15
• 1.3 杆状病毒几丁质酶的研究15-17
• 1.3.1 杆状病毒几丁质酶的功能15-16
• 1.3.2 HearNPV几丁质酶基因的研究16-17
• 1.4 研究目的意义17
• 1.5 技术路线17-18
• 第二章 实验材料与方法18-32
• 2.1 实验材料18-21
• 2.1.1 植物材料18
• 2.1.2 供试虫体18
• 2.1.3 供试病毒和菌株18
• 2.1.4 载体18-19
• 2.1.4.1 pGEM?-T Easy Vector18-19
• 2.1.4.2 植物表达载体pSR784d19
• 2.1.5 主要试剂和试剂盒19-20
• 2.1.6 培养基及常用溶液配制20-21
• 2.1.6.1 细菌培养基20
• 2.1.6.2 缓冲液20
• 2.1.6.3 碱裂解法质粒抽提液20-21
• 2.1.6.4 CTAB法基因组抽提液21
• 2.1.6.5 主要抗生素的配制21
• 2.1.6.6 其他试剂的配制21
• 2.2 实验方法21-32
• 2.2.1 重组植物表达载体的构建21-24
• 2.2.1.1 PCR引物的设计及合成21
• 2.2.1.2 PCR扩增21-22
• 2.2.1.3 PCR产物纯化、平末端加A反应及T载体连接反应22-23
• 2.2.1.4 氯化钙法制备新鲜的大肠杆菌TG1感受态细胞23
• 2.2.1.5 连接产物转化大肠杆菌TG1感受态细胞23
• 2.2.1.6 碱裂解法提取质粒DNA23-24
• 2.2.1.8 限制性内切酶酶切反应24
• 2.2.1.9 植物表达载体pSR784d与Chitinase基因片段的粘性末端连接反应24
• 2.2.2 重组载体Chitinase-pSR784d转化农杆菌LBA440424-25
• 2.2.2.1 氯化钙法制备新鲜农杆菌LBA4404感受态细胞24-25
• 2.2.2.2 电穿孔法转化农杆菌LBA4404感受态细胞25
• 2.2.3 拟南芥转化和转基因株系的获得25-26
• 2.2.3.1 拟南芥室内培养25
• 2.2.3.2 农杆菌LBA4404转化液的制备25-26
• 2.2.3.3 拟南芥花序侵染26
• 2.2.3.4 转化后拟南芥培养和种子的收获26
• 2.2.3.5 转基因拟南芥的筛选26
• 2.2.4 T_3代转基因拟南芥的分子检测26-29
• 2.2.4.1 转基因拟南芥基因组PCR检测26-28
• 2.2.4.2 T3代转基因拟南芥的定量RT-PCR（Quantitative RT-PCR）分析28-29
• 2.2.5 Chitinase转基因拟南芥对HearNPV增效作用的试验29-32
• 2.2.5.1 取食转基因植株和HearNPV的棉铃虫的LT50和LT90的测定29
• 2.2.5.2 取食转基因植株和HearNPV的棉铃虫体内病毒拷贝数的测定29-30
• 2.2.5.3 取食转基因植株并感染HearNPV后的棉铃虫病毒产量的测定30
• 2.2.5.4 取食转基因植株HearNPV的棉铃虫体幼虫日均累积增重量的测定30-32
• 第三章 实验结果分析32-41
• 3.1 Chitinase重组植物表达载体的构建32-33
• 3.1.1 Chitinase基因的克隆及测序32-33
• 3.1.2 重组植物表达载体Chitinase-pSR784d的构建33
• 3.2 Chitinase转基因拟南芥的获得33-34
• 3.3 T_3代转基因拟南芥的分子检测34-36
• 3.3.1 PCR检测34-35
• 3.3.2 实时荧光定量RT-PCR分析35-36
• 3.4 转Chitinase基因拟南芥对HearNPV的增效作用36-41
• 3.4.1 LT_(50)和LT_(90)的测定36-38
• 3.4.2 不同处理棉铃虫细胞内的病毒DNA的定量检测38-39
• 3.4.3 不同处理棉铃虫体内的病毒产量39-40
• 3.4.4 棉铃虫日累积增重的测定40-41
• 第四章 结论与讨论41-43
• 4.1 结论41
• 4.2 讨论41-43
• 参考文献43-47
• 致谢47-48
• 作者简介48

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本文编号：361941