大麦盐诱导根系表达基因HvSR1的鉴定及其功能分析专用载体的构建

发布时间：2017-05-14 04:02

  本文关键词：大麦盐诱导根系表达基因HvSR1的鉴定及其功能分析专用载体的构建，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：盐胁迫能够显著影响作物的产量和品质,而根系是植物体应答盐胁迫不可或缺的营养器官,发掘盐诱导根系表达相关基因并进行分子育种,是作物耐盐遗传改良的重要途径之一。大麦是一个重要的模式作物,其基因组已完成测序。随着测序技术的发展,大麦转录组数据急剧增长,迫切需要进行数据的发掘和鉴定。本试验利用Genevestigator在线生物信息学程序,分析了8个实验中的48个样品的数据,筛选到四个盐诱导根系表达候选基因。以大麦Morex为试验材料,对基因在不同组织器官和不同盐处理条件下的表达模式进行验证,并构建用于大麦基因功能分析的专用载体。结果表明,探针Hv.1961对应的基因在大麦根系受盐胁迫诱导显著上调表达,命名为HvSR1基因(Salt Responsive Gene 1)。编码区全长为1377个核苷酸,共编码458个氨基酸;含有2个蛋白家族的保守结构域,其中DUF247是植物中的一种未知功能蛋白。Csb2_I-U家族可以编码CRISPR/CAS系统相关蛋白Csb2。对生物信息学的结果进行了验证。结果显示该基因在大麦幼根和成根中表达量较高,且成根中的表达量最高,在其它器官中表达量均很低,甚至检测不到,表明该基因的表达具有根部特异性。在大麦幼根,该基因的表达量随胁迫时间的增加而升高,证明了盐胁迫诱导了该基因在根部的上调表达。构建了两个用于大麦基因功能分析的载体。pEGFP-UN将选择标记基因NPTII置于玉米的强启动子Ubiquitin的控制之下,且在T-DNA插入基因启动子增强区时,能启动报告基因GFP的表达。pBA9N载体含有卡那霉素抗性标记基因,并受Ubiquitin启动子的调控,其大小仅有6478 bp。这两个载体为构建大麦的突变体库奠定了很好的前期基础。
【关键词】：大麦 盐胁迫可诱导基因 根部特异性基因 T-DNA Ubiquitin启动子
【学位授予单位】：天津农学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S512.3;Q943.2
【目录】：

• 摘要15-16
• Abstract16-18
• 第一章 引言18-32
• 1 文献综述18-29
• 1.1 土壤盐渍化及其危害植物的作用机理18-20
• 1.1.1 土壤盐渍化18-19
• 1.1.2 土壤盐渍化危害植物生长的作用机理19-20
• 1.2 植物的耐盐机制20-25
• 1.2.1 植物的耐盐性及耐盐机制的种类20-21
• 1.2.2 植物形态上的适应性21-22
• 1.2.3 渗透调节22
• 1.2.4 拒盐和离子区隔化22-23
• 1.2.5 活性氧清除机制23-24
• 1.2.6 植物盐胁迫信号转导24-25
• 1.3 大麦耐盐性的研究进展25-26
• 1.4 生物信息学在发现抗逆相关基因中的应用26
• 1.5 基因功能分析专用载体简介26-29
• 1.5.1 绿色荧光蛋白简介26-27
• 1.5.2 Ubiquitin启动子简介27-28
• 1.5.3 NPTII基因简介28
• 1.5.4 pUCm-T克隆载体简介28-29
• 2 本文研究的内容29-30
• 3 本试验的研究意义30-32
• 第二章 大麦盐诱导根系表达基因HvSR1的鉴定32-45
• 1 材料32-35
• 1.1 试验材料32-33
• 1.1.1 试验植物32
• 1.1.2 生物信息学软件32
• 1.1.3 PCR引物32-33
• 1.2 主要药品与试剂的配置33-34
• 1.2.1 药品33
• 1.2.2 主要试剂的配置33-34
• 1.3 主要仪器和设备34-35
• 2 试验方法35-38
• 2.1 大麦的种植方法35
• 2.2 生物信息学筛选目的基因35
• 2.3 大麦幼苗根部盐处理试验35-36
• 2.4 大麦各个组织器官取材试验36
• 2.5 大麦各个组织器官及盐处理植株幼根RNA的提取及cDNA的制备36-37
• 2.5.1 大麦各个组织器官及盐处理植株幼根RNA的提取36
• 2.5.2 大麦cDNA的制备36-37
• 2.6 检测反转录产物37
• 2.7 用特异性引物扩增cDNA验证目的基因的表达模式37-38
• 3 结果与分析38-43
• 3.1 生物信息学筛选根部特异性盐诱导基因38-40
• 3.1.1 利用Genevestigator数据库初步筛选目的基因38-39
• 3.1.2 基因CDS序列的获得39-40
• 3.2 RT-PCR验证基因HvSR1在各个组织器官中的表达量模式40
• 3.3 RT-PCR验证盐胁迫下基因HvSR1在根部的表达模式40
• 3.4 HvSR1基因的序列分析40-43
• 4 讨论43-45
• 第三章 用于单子叶植物转化的绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-UN的构建45-62
• 1 材料45-48
• 1.1 试验材料45
• 1.1.1 生物信息学软件45
• 1.1.2 PCR引物45
• 1.1.3 质粒和菌种45
• 1.2 主要药品与试剂的配制45-48
• 1.2.1 主要药品45-46
• 1.2.2 主要试剂的配置46-47
• 1.2.3 主要仪器和设备47-48
• 2 试验方法48-54
• 2.1 质粒的活化48-49
• 2.2 pEASY-ubi-npt II质粒的提取49
• 2.3 PCR扩增目的片段ubi-npt II49-50
• 2.4 目的片段Ubi-npt II的回收50
• 2.5 回收目的片段的加A反应50-51
• 2.6 加A产物与克隆载体pUCm-T的连接51
• 2.7 大肠杆菌感受态细胞DH5α的制备51-52
• 2.8 连接产物的热激转化52
• 2.9 菌落PCR筛选阳性转化菌株52-53
• 2.10 所筛选产物的测序53
• 2.11 重组质粒pUCm-T-Ubi-NPTII与pEGFP质粒的提取53
• 2.12 重组质粒和pEGFP载体的双酶切及回收53-54
• 2.13 酶切后pEGFP载体与目的片段的连接与转化54
• 2.14 重组质粒pEGFP-UN的测序鉴定与保存54
• 3 结果与分析54-60
• 3.1 对目的片段Ubi-npt II的扩增与回收54-56
• 3.1.1 目的片段的扩增54-55
• 3.1.2 目的片段的胶回收55-56
• 3.2 目的片段ubi-npt II与克隆载体pUCm-T的连接反应转化产物的鉴定与测序56-58
• 3.2.1 菌落PCR筛选鉴定阳性菌落56-57
• 3.2.2 菌落PCR筛选的阳性菌落的测序57-58
• 3.3 克隆载体pUCm-T-Ubi-NPTII与pEGFP质粒的提取、双酶切及回收58-59
• 3.3.1 克隆载体和pEGFP的提取和双酶切58
• 3.3.2 酶切片段的回收及检测58-59
• 3.4 双酶切回收产物的连接、转化与测序鉴定59-60
• 4 讨论60-62
• 4.1 单子叶植物转基因体系的建立及现有的用于阳性植株筛选的主要载体资源60
• 4.2 载体pEGFP-UN的优点60-61
• 4.3 实验过程中的问题及解决61-62
• 第四章 禾谷类作物T-DNA插入突变体库专用载体pBA9N的构建62-74
• 1 材料62-65
• 1.1 试验材料62
• 1.1.1 生物信息学软件62
• 1.1.2 PCR引物62
• 1.1.3 质粒和菌种62
• 1.2 主要药品与试剂的配制62-64
• 1.2.1 主要药品62-63
• 1.2.2 主要试剂的配制63-64
• 1.3 主要仪器和设备64-65
• 2 试验方法65-69
• 2.1 目的片段的获得65-67
• 2.1.1 pBract806、pDONR(amp)、pEASY-ubi-npt II质粒的活化65
• 2.1.2 pBract806、pDONR(amp)、pEASY-ubi-npt II质粒的提取65-66
• 2.1.3 PCR扩增目的片段66-67
• 2.1.4 目的片段NptⅡ-attB的回收67
• 2.2 入门载体的构建67-68
• 2.2.1 BP反应67-68
• 2.2.2 入门载体转化大肠杆菌细胞68
• 2.2.3 入门载体的菌落PCR鉴定68
• 2.3 表达载体的构建68-69
• 2.3.1 LR反应68-69
• 2.3.2 表达载体转化大肠杆菌细胞69
• 2.3.3 表达载体的菌落PCR鉴定69
• 3 结果与分析69-73
• 3.1 目的片段NptⅡ-attB的扩增69-70
• 3.2 入门载体pDONRN的构建70-71
• 3.3 表达载体pBA9N的构建71-73
• 4 讨论73-74
• 第五章 结论74-76
• 参考文献76-82
• 致谢82-83
• 攻读硕士期间发表的论文83

【参考文献】

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  本文关键词：大麦盐诱导根系表达基因HvSR1的鉴定及其功能分析专用载体的构建，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：364209