斑马鱼DNA聚合酶Delta四亚基和相关因子的制备鉴定及赤点石斑鱼IκBα基因的克隆与功能分析

发布时间：2017-05-14 08:00

  本文关键词：斑马鱼DNA聚合酶Delta四亚基和相关因子的制备鉴定及赤点石斑鱼IκBα基因的克隆与功能分析，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：本研究论文的第一部分是斑马鱼的DNA聚合酶Delta(Polymerase Delta,polδ)四个亚基(Pold1,Pold2,Pold3,Pold4)基因的重组质粒构建和真核表达以及斑马鱼PCNA基因的克隆、原核表达及其互作蛋白的鉴定等方面的初步探索。经典模式生物斑马鱼体内87%的基因与人源基因相似,这意味着斑马鱼不仅可以用于研究鱼类病原体感染途径及致病机理,也可用于探究人类疾病的致病机理。真核细胞DNA polδ是染色体DNA复制中主要的复制酶,也参与多种形式的DNA损伤修复过程。而细胞增殖抗原(Proliferating cell nuclear antigen,PCNA)作为引导DNA polδ至复制叉上发挥作用的重要辅助因子,在DNA复制和DNA损伤修复等细胞活动中发挥重要的作用。近年来,polδ的大规模分离纯化技术已经有很大的进步,其具体生理生化功能也有大量的研究报道,但斑马鱼DNA polδ的研究报道甚少。本研究将斑马鱼DNA polδ的一个或多个亚基基因与杆状病毒转移载体pFBDM进行质粒构建,获得不同亚基基因组合的重组质粒。利用新型的MultiBac杆状病毒表达系统制备了含有斑马鱼DNA polδ不同亚基组合的重组病毒。同时尝试利用真核系统制备重组polδ酶蛋白复合物。Western Blot分析表明,斑马鱼DNA polδ各亚基在Sf-9细胞中均能成功表达;质谱分析结果进一步证实各重组蛋白分别由Pold1、Pold2、Pold4所编码。本研究还对斑马鱼PCNA基因进行了克隆和重组质粒的构建,并通过原核表达系统表达纯化了重组PCNA蛋白。利用CNBr-activated SepharoseTM 4B制备重组PCNA蛋白亲和层析柱,结合亲和层析及质谱技术筛选鉴定斑马鱼PCNA的互作蛋白。质谱鉴定结果显示PCNA互作蛋白主要参与DNA复制、损伤修复、细胞周期调控等细胞生理活动。本部分的研究为深入研究polδ在机体繁殖和胚胎发育的功能奠定了基础,为后续开发斑马鱼polδ缺陷型相关疾病模型提供依据。本论文的第二部分进行了赤点石斑鱼NF-κB因子抑制蛋白IκBα基因的分子克隆与功能分析。水产养殖环境的恶化给我国鱼类养殖业带来了巨大的损失。石斑鱼是重要的养殖经济鱼类,研究其自身免疫相关基因及其作用机制,有利于提高石斑鱼的免疫力及抗病力而达到健康养殖的目的。NF-κB信号转导通路作为联系天然免疫系统和特异性免疫系统的纽带,参与机体免疫和发育的多种生理活动。本研究通过5'-和3'-RACE技术克隆并鉴定了一个编码赤点石斑鱼NF-κB因子抑制蛋白IκBα基因(命名为EaIκBα)。为进一步分析其表达模式及抗病毒能力,本研究对EaIκBα基因进行原核表达并检测其在石斑鱼各组织的表达情况。研究结果显示,EaIκBα基因在免疫组织血细胞、头肾以及肝脏中都有较高的表达。经LPS、溶藻弧菌和石斑鱼虹彩病毒SGIV刺激石斑鱼后,对EaIκBα在头肾中的表达情况进行实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析,结果显示其表达量都有不同程度的升高,表明EaIκBα在细菌和病毒的感染中发挥了相对重要的作用。另外,研究结果显示,过表达的EaIκBα能抑制SGIV感染的致细胞病变效应(CPE)进程,降低病毒主要衣壳蛋白MCP和核心蛋白ORF162的表达。综上研究结果表明,EaIκBα在宿主抵御细菌和病毒感染的免疫反应中发挥了重要的作用,为进一步探索石斑鱼免疫机制提供新的理论依据。
【关键词】：斑马鱼 DNApolδ PCNA 赤点石斑鱼 IκBα 分子克隆 重组表达
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q78;S917.4
【目录】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-11
• 第一章 绪论11-24
• 1.1 经典模式生物斑马鱼的研究现状11-13
• 1.1.1 细菌及病毒感染斑马鱼模型的研究11-12
• 1.1.2 斑马鱼模型与人类疾病的研究12-13
• 1.2 真核生物DNA聚合酶 δ 的研究进展13-16
• 1.2.1 DNA聚合酶 δ 的亚基组成及功能13-14
• 1.2.2 DNA pol δ-杆状病毒表达系统的建立14-15
• 1.2.3 DNA聚合酶 δ 与人类疾病15-16
• 1.3 细胞增殖抗原PCNA的研究现状16-18
• 1.4 石斑鱼及其疾病模型研究进展18-21
• 1.4.1 NF-κB信号通路在鱼类先天性免疫中的作用的研究进展18-20
• 1.4.2 石斑鱼及其疾病研究20-21
• 1.5 立题依据及研究内容21-24
• 1.5.1 本论文的立题依据21-23
• 1.5.2 本论文的研究内容23-24
• 第二章 斑马鱼DNA pol δ 四亚基基因的克隆、重组病毒的制备及真核表达24-56
• 2.1 材料与试剂24-29
• 2.1.1 实验用鱼种、载体、受体菌及细胞株24
• 2.1.2 主要的实验仪器设备24-25
• 2.1.3 实验试剂及配制方法25-29
• 2.2 方法29-43
• 2.2.1 斑马鱼mRNA的提取29-30
• 2.2.2 斑马鱼cDNA模板的合成30-31
• 2.2.3 相关的引物设计31-32
• 2.2.4 斑马鱼DNA pol δ 四亚基与pFBDM重组质粒的构建32-39
• 2.2.5 蓝白斑筛选重组Bacmids39-40
• 2.2.6 Sf-9 细胞的悬浮培养40
• 2.2.7 脂质体包埋法制备重组病毒40-41
• 2.2.8 目的蛋白的表达与Western Blot检测41-43
• 2.2.9 质谱鉴定样品43
• 2.3 结果与分析43-54
• 2.3.1 斑马鱼DNA聚合酶Delta四亚基基因的克隆结果分析43-47
• 2.3.2 斑马鱼DNA pol δ 四亚基不同组合重组Bacmids的PCR鉴定47-48
• 2.3.3 各亚基组合在真核系统中表达分析48-52
• 2.3.4 质谱鉴定分析52-54
• 2.4 小结与讨论54-56
• 第三章 斑马鱼细胞增殖抗原（PCNA）的克隆与原核表达纯化及应用56-72
• 3.1 材料与试剂56-57
• 3.1.1 材料56
• 3.1.2 试剂56-57
• 3.1.3 主要仪器设备57
• 3.2 方法57-64
• 3.2.1 一般实验方法57
• 3.2.2 斑马鱼PCNA基因的重组构建57-58
• 3.2.3 PCNA蛋白在大肠杆菌E. coli BL21(DE3)中诱导表达58-59
• 3.2.4 目的蛋白的分离纯化59-61
• 3.2.5 目的蛋白与CNBr-activated SepharoseTM 4B耦联61-62
• 3.2.6 目的蛋白-SepharoseTM 4B亲和层析柱的应用62-64
• 3.3 结果与分析64-70
• 3.3.1 斑马鱼PCNA的基因克隆分析64-65
• 3.3.2 斑马鱼PCNA蛋白的诱导表达65-66
• 3.3.3 斑马鱼PCNA蛋白的大规模分离纯化66-67
• 3.3.4 PCNA亲和层析柱的制备及应用67-69
• 3.3.5 QE质谱结果分析69-70
• 3.4 小结与讨论70-72
• 第四章 赤点石斑鱼NF-κB因子抑制蛋白IκBα 基因的分子克隆与功能研究72-88
• 4.1 材料与试剂72
• 4.1.1 实验动物、细胞、病毒及其它微生物细胞72
• 4.1.2 质粒载体和受体菌株72
• 4.1.3 试剂盒及试剂72
• 4.2 方法72-79
• 4.2.1 SGIV病毒的扩增72-73
• 4.2.2 组织样品的采集及免疫刺激73
• 4.2.3 赤点石斑鱼mRNA提取及cDNA的合成73
• 4.2.4 相关引物设计73-74
• 4.2.5 以 5'-和 3'-RACE技术扩增目的基因编码序列74-76
• 4.2.6 pET28a-EaIκBα 原核表达重组质粒的构建76-77
• 4.2.7 重组蛋白的诱导表达77-78
• 4.2.8 实时荧光定量PCR检测EaIκBα mRNA表达78
• 4.2.9 EaIκBα 抗病毒活性分析78-79
• 4.3 结果与分析79-86
• 4.3.1 EaIκBα 全长扩增和序列分析79-80
• 4.3.2 EaIκBα 氨基酸序列的同源性分析及进化关系80-82
• 4.3.3 石斑鱼EaIκBα 基因表达模式分析82-84
• 4.3.4 EaIκBα 的原核表达结果分析84
• 4.3.5 EaIκBα 抗病毒活性分析84-86
• 4.4 小结与讨论86-88
• 总结与展望88-90
• 总结88-89
• 展望89-90
• 参考文献90-98
• 致谢98-99
• 在学期间发表的学术论文及其他科研成果99

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