纳米金非侵入性介导外源基因进入小鼠早期胚胎细胞的研究
发布时间：2022-02-08 19:33
将特定的外源基因导入真核细胞中,并整合到受体细胞基因组中得到稳定表达的技术,称为基因导入,它是改变生物遗传性状的根本途径。目前,显微注射是目前使用较为广泛的基本技术,它的优势是基因导入效果相对稳定,成功率也比较高。但是,实现这些优点需要熟练的技术人员和拥有昂贵的实验仪器。同时,在显微镜下通过精细的操作来避免卵母细胞的损伤和精确的控制DNA注射量来确保卵母细胞的安全都是有相当困难的,并且只能够一个接一个的进行注射,处理样品的数量有限。因此,传统的将外源基因物质转入胚胎细胞的方法已不能满足当前研究的要求,特别是利用CRISPR/Cas9进行基因编辑和RNA干扰进行基因沉默等技术的进步,也迫切的需要一种新的方法来取代传统的技术方法。本研究使用聚乙烯亚胺（PEI）包裹的金纳米粒子（AuNPs）负载质粒DNA成功的构建出了一种行之有效的基因载体系统,在尽量减轻胚胎细胞所受伤害的同时降低了技术难度。本研究将小鼠受精卵在含有AuNPs@PEI@DNA载体复合物（APD）的KSOM培养基中培养,培养至囊胚形成后植入假孕母鼠体内,从而获得转基因后代。通过荧光观察,证实了GFP在早期胚胎细胞中的表达,并且...
【文章来源】：阜阳师范大学安徽省
【文章页数】：73 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
常用于基因导入的阳离子聚合物
第1章综述6带正电荷的氨基基团能与DNA分子中带负电荷的磷酸基团通过静电吸附作用相互结合。PEI具有很强的负载和压缩质粒DNA的能力，所形成的球形复合物粒径不超过100nm，能有效的被细胞摄取内吞，并可以使DNA逃脱胞内溶酶体的吞噬，免受核酸酶降解，从而可以将外源基因物质导入到细胞核内并表达[61]。然而，PEI的转染效率和细胞毒性都与其分子量紧密相关，高分子量的PEI在大多数哺乳细胞系中均表现出较高的转染效率，但高分子量的PEI由于表面正电荷的富集，有着较高的细胞毒性，从而限制了它的应用[62]。另一方面，研究表明虽然低分子量的PEI细胞毒性很低，但是由于它不能有效的与DNA缩合[63]，导致其转染效率较低[64]。1.3.1.2脂质体(Liposomes)脂质体是由磷脂和神经酰胺等物质通过自组装制得的具有内空腔的脂质囊泡，其双分子层结构与细胞膜结构相同。在水中，磷脂分子亲水头端插入水中，脂质体疏水尾端伸向空气，搅动后便可形成双层脂分子的球形封闭囊泡，称为脂质体，直径25~1000nm不等，如Fig1-2所示。图1-2脂质体的构造示意Fig1-2Thestructureofliposomes脂质体制备相对比较简单，亲水基团和连接基团的多样化使其可以同时容纳疏水和亲水性的物质，可以携带较多的外源基因物质导入各类细胞，且有着较高的转染效率[65]。目前，部分阳离子脂质体已经商业化，使用成品试剂可以稳定的将外源基因导入一些种类的细胞中。但是，相比脂质体体外转染较高的转染率，其体内转染率则显著降低，且毒性较高[66]。1.3.2无机纳米粒子载体无机纳米粒子制备相对简单、易保存，其在基因载体中的应用已经成为了新的研
等[73]特点。其中，金纳米粒子（AuNp）是目前研究较为深入和广泛的一种金属纳米材料，因其独特的物理化学性质和较好的生物相容性而在基因治疗和生物学研究中有着广泛的应用。金纳米粒子是生物惰性材料，在大多文献中被认为基本无毒[74]，而且它制备简单，粒径可控，容易通过与各种基团的结合作用而实现功能化。特别是粒径小的金纳米粒子比表面积巨大，便于在其表面进行高密度的接枝，从而彻底改变粒子的表面性质[75]比如，可以将一定分子量的PEI接枝到金纳米粒子上，从而提高其对DNA的结合力，进而提高转染效率。图1-3以纳米金为核心包覆PEI构建基因载体Fig1-3ThegenecarrierconsistsofgoldnanoparticlescoatedwithPEI1.3.2.4纳米二氧化硅（nano-silicondioxide）纳米二氧化硅，俗称白炭黑，目前其制备技术已十分成熟，粒径范围一般在1-100nm之间，因小尺寸效应、表面效应和宏观量子隧道效应而具有独特的性质，在催化、滤光、医药、磁介质等方面有着广泛的应用。纳米二氧化硅易于进行表面修饰而实现生物功能化，良好的生物相容性使其可以用于药物递送和基因物质的导入。如使用氯硅烷或氯化钠修饰的二氧化硅纳米粒子可以用于外源基因物质导入活体细胞，在无细胞毒性的基础上，实现较高的转染效率[76]，并在应用于活体小鼠实验中，也未发现组织和细胞的病态变化。纳米二氧化硅因其独特的多孔结构，适于作为外源基因物质载体的同时，可以装载荧光染料，在介导外源基因物质导入受体细胞的同时实现示踪功能[77]。
【参考文献】：
期刊论文
[1]聚乙烯亚胺修饰纳米金基因载体制备及体外实验研究[J]. 蒋家云,邹孟达,陈施瀚,邓青松,谭运华,夏峰,马宽生. 第三军医大学学报. 2016(09)
博士论文
[1]聚乙烯亚胺修饰的无机纳米粒子作为基因载体的研究[D]. 胡楚.武汉大学 2010
硕士论文
[1]生物体内可降解的聚乙烯亚胺类基因载体的设计与应用[D]. 匡佳.大连理工大学 2019
本文编号：3615626
【文章来源】：阜阳师范大学安徽省
【文章页数】：73 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
常用于基因导入的阳离子聚合物
第1章综述6带正电荷的氨基基团能与DNA分子中带负电荷的磷酸基团通过静电吸附作用相互结合。PEI具有很强的负载和压缩质粒DNA的能力，所形成的球形复合物粒径不超过100nm，能有效的被细胞摄取内吞，并可以使DNA逃脱胞内溶酶体的吞噬，免受核酸酶降解，从而可以将外源基因物质导入到细胞核内并表达[61]。然而，PEI的转染效率和细胞毒性都与其分子量紧密相关，高分子量的PEI在大多数哺乳细胞系中均表现出较高的转染效率，但高分子量的PEI由于表面正电荷的富集，有着较高的细胞毒性，从而限制了它的应用[62]。另一方面，研究表明虽然低分子量的PEI细胞毒性很低，但是由于它不能有效的与DNA缩合[63]，导致其转染效率较低[64]。1.3.1.2脂质体(Liposomes)脂质体是由磷脂和神经酰胺等物质通过自组装制得的具有内空腔的脂质囊泡，其双分子层结构与细胞膜结构相同。在水中，磷脂分子亲水头端插入水中，脂质体疏水尾端伸向空气，搅动后便可形成双层脂分子的球形封闭囊泡，称为脂质体，直径25~1000nm不等，如Fig1-2所示。图1-2脂质体的构造示意Fig1-2Thestructureofliposomes脂质体制备相对比较简单，亲水基团和连接基团的多样化使其可以同时容纳疏水和亲水性的物质，可以携带较多的外源基因物质导入各类细胞，且有着较高的转染效率[65]。目前，部分阳离子脂质体已经商业化，使用成品试剂可以稳定的将外源基因导入一些种类的细胞中。但是，相比脂质体体外转染较高的转染率，其体内转染率则显著降低，且毒性较高[66]。1.3.2无机纳米粒子载体无机纳米粒子制备相对简单、易保存，其在基因载体中的应用已经成为了新的研
等[73]特点。其中，金纳米粒子（AuNp）是目前研究较为深入和广泛的一种金属纳米材料，因其独特的物理化学性质和较好的生物相容性而在基因治疗和生物学研究中有着广泛的应用。金纳米粒子是生物惰性材料，在大多文献中被认为基本无毒[74]，而且它制备简单，粒径可控，容易通过与各种基团的结合作用而实现功能化。特别是粒径小的金纳米粒子比表面积巨大，便于在其表面进行高密度的接枝，从而彻底改变粒子的表面性质[75]比如，可以将一定分子量的PEI接枝到金纳米粒子上，从而提高其对DNA的结合力，进而提高转染效率。图1-3以纳米金为核心包覆PEI构建基因载体Fig1-3ThegenecarrierconsistsofgoldnanoparticlescoatedwithPEI1.3.2.4纳米二氧化硅（nano-silicondioxide）纳米二氧化硅，俗称白炭黑，目前其制备技术已十分成熟，粒径范围一般在1-100nm之间，因小尺寸效应、表面效应和宏观量子隧道效应而具有独特的性质，在催化、滤光、医药、磁介质等方面有着广泛的应用。纳米二氧化硅易于进行表面修饰而实现生物功能化，良好的生物相容性使其可以用于药物递送和基因物质的导入。如使用氯硅烷或氯化钠修饰的二氧化硅纳米粒子可以用于外源基因物质导入活体细胞，在无细胞毒性的基础上，实现较高的转染效率[76]，并在应用于活体小鼠实验中，也未发现组织和细胞的病态变化。纳米二氧化硅因其独特的多孔结构，适于作为外源基因物质载体的同时，可以装载荧光染料，在介导外源基因物质导入受体细胞的同时实现示踪功能[77]。
【参考文献】：
期刊论文
[1]聚乙烯亚胺修饰纳米金基因载体制备及体外实验研究[J]. 蒋家云,邹孟达,陈施瀚,邓青松,谭运华,夏峰,马宽生. 第三军医大学学报. 2016(09)
博士论文
[1]聚乙烯亚胺修饰的无机纳米粒子作为基因载体的研究[D]. 胡楚.武汉大学 2010
硕士论文
[1]生物体内可降解的聚乙烯亚胺类基因载体的设计与应用[D]. 匡佳.大连理工大学 2019
本文编号：3615626
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