CRISPR/Cpf1基因编辑系统在家蚕细胞中的建立及应用
发布时间：2022-02-09 03:11
规律成簇的短回文重复序列（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR）是原核生物基因组中的重复序列,是在细菌生命进化过程中与病毒相互对抗时出现的一种免疫系统,运用此系统,细菌能够从它们的染色体上切除病毒基因。近年来研究人员将CRISPR系统开发作为基因编辑工具已成功应用于小鼠、人类细胞、烟草和微生物等多种模式生物中。家蚕作为一种重要的模式生物,家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV）是蚕业上的主要蚕病之一,严重制约着蚕桑产业的发展。而随着对CRISPR系统的深入探究发现CRISPR家族的新成员Cpf1,它同时具有DNA酶和RNA酶活性,使得Cpf1编辑系统在结构和作用机理上存在着更多的优势。因此,迫切需要在家蚕模式生物中建立Cpf1编辑系统,利用其优势高效地作用于BmNPV基因组,提高家蚕抗病毒能力。本研究首先构建家蚕AsCpf1、FnCpf1和LbCpf1编辑系统,检测其编辑能力;进而构建靶标BmNPV ie1的敲除载体,分析敲除BmNPV ...
【文章来源】：西南大学重庆市211工程院校教育部直属院校
【文章页数】：74 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
基因编辑技术原理[1]
t被spacer序列相隔开。CRISPR通过spacer和靶标基因进行识别，储存和记录外源核酸入侵的信息。前导区位于CRISPR阵列前，和repeat序列相连，用于启动CRISPR的转录即前体crRNA（PrecursortranscriptRNA，pre-crRNA），而对应的反义链上的pre-crRNA也会经过转录和转录后加工，形成互补的反式激活crRNA（TransactivatingcrRNA，tracr-RNA）[71]。Cas是位于CRISPR附近的一种双链DNA核酸酶，和tracr-RNA和crRNA形成复合物，在gRNA的引导作用下对CRISPR识别的靶标位点切割，功能和FokI类似，但不需要形成二聚体来发挥功能。图1.2CRISPR/Cas的组成结构图[70]。Figure1.2CompositionofCRISPR/Cas[70].
西南大学硕士学位论文4CRISPR/Cas系统是细菌抵抗外界遗传物质入侵的自身免疫系统，可以在入侵的基因组中插入新的间隔序列；当相同的外源基因再次入侵时，会定向靶标切割外源基因，能够为细菌提供特异性的免疫保护。CRISPR/Cas系统的作用机制一般分三步[72]：（1）适应阶段，是cas蛋白识别获取spacer和其下游的前间区序列邻近基序（Protospaceradjacentmotif，PAM）序列的过程，而且各个CRISPR/Cas系统的PAM也不一样。当外源基因入侵时，Cas蛋白识别剪切spacer并插入到leader序列和其相邻repeat序列中间，从而组成新的spacer序列。以防相同的外源基因入侵时，能对其基因组剪切，阻断其复制和表达。（2）表达阶段，是crRNA的加工和成熟过程。leader序列启动CRISPR序列的转录，转录后形成的长链RNA为pre-crRNA，随后被相关Cas蛋白加工剪切成成熟的含单一spacer的crRNA，并且crRNA序列是和靶标基因互补的。（3）免疫干扰，成熟的crRNA能够和Cas蛋白等组成复合物，从而引导Cas蛋白对外源基因的剪切。并且不同的CRISPR系统的复合物也不同（图1.3）。图1.3CRISPR/Cas系统分子机制[72]。Figure1.3MolecularmechanismofCRISPR/Cassystem[72].1.2.2CRISPR/Cas系统的分类Cas蛋白作为CRISPR相关蛋白，一般情况下每种CRISPR/Cas系统包含4~10个Cas基因串联组成[73]。根据Cas基因数目和序列的不同，将CRISPR/Cas系统分为2个类型：Class1和2[74,75]。第1类CRISPR/Cas系统分为I型标签基因为Cas3、
【参考文献】：
期刊论文
[1]CRISPR/Cas9技术构建Vegf-b敲除斑马鱼模型和心血管发育异常的初探[J]. 宋来思,赵海山,吴文富,冯启荣,谭文. 广东药科大学学报. 2020(02)
[2]利用CRISPR/Cpf1系统构建稳定敲除LncRNA458314的肾癌细胞株及其功能探讨[J]. 周洋,陈兵海,王诚悦. 江苏大学学报(医学版). 2020(01)
[3]Construction of a One-Vector Multiplex CRISPR/Cas9 Editing System to Inhibit Nucleopolyhedrovirus Replication in Silkworms[J]. Zhanqi Dong,Qi Qin,Zhigang Hu,Peng Chen,Liang Huang,Xinling Zhang,Ting Tian,Cheng Lu,Minhui Pan. Virologica Sinica. 2019(04)
[4]利用CRISPR/Cas9技术产生肌肉特异表达Cas9的小鼠胚胎[J]. 李昊,陈胜男,李松美,朴善花,安铁洙,王春生. 中国实验动物学报. 2019(03)
[5]利用TALEN技术编辑水稻光温敏核不育基因PMS3[J]. 林艳,刘华清,付艳萍,吴明基. 福建农业学报. 2019(04)
[6]基因编辑技术原理及其在动植物研究中的应用[J]. 张泗举,栾维江. 天津师范大学学报(自然科学版). 2019(03)
[7]CRISPR家族新成员:CRISPR-Cpf1[J]. 周晨晨,刘写写,谢海华,谷峰. 生物化学与生物物理进展. 2018(06)
[8]CRISPR/Cas系统抵御细菌耐药[J]. 徐艳,崔玉晓,杨洋,罗义,郑向群,毛大庆. 生态毒理学报. 2018(03)
[9]谷氨酸棒状杆菌CRISPR-Cpf1和Cre/loxP基因敲除技术的比较[J]. 占米林,阚宝军,张辉,董晋军,许国超,韩瑞枝,倪晔. 微生物学通报. 2019(02)
[10]类转录激活因子效应物核酸酶介导的E-cad和Bmi-1基因联合干预鼻咽癌的体外研究[J]. 罗婷婷,严爱芬,刘连,蒋泓,冯翠兰,刘冠男,刘芳,唐冬生,周天鸿. 中南大学学报(医学版). 2018(03)
博士论文
[1]CRISPR/Cas9基因敲除技术在家蚕基因功能研究中的应用[D]. 辛虎虎.浙江大学 2015
[2]基于基因组编辑的家蚕丝腺遗传改良与应用研究[D]. 马三垣.西南大学 2014
[3]靶向HPV E6E7基因的TALEN的构建及应用研究[D]. 丁文成.华中科技大学 2014
硕士论文
[1]利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建Ndufs4基因敲除小鼠和STRA8-eGFP转基因小鼠的研究[D]. 吴汗.南方医科大学 2018
[2]使用CRISPR/Cas诱导淋巴细胞中CCR5基因突变为CCR5Δ32的研究[D]. 齐春侠.南开大学 2017
[3]Talen介导的SP110基因定位整合于PRNP基因位点的抗结核、抗瘙痒病羊的研制[D]. 吉小芳.扬州大学 2017
[4]利用TALEN技术定点突变水稻DST基因[D]. 罗伟锋.黑龙江大学 2017
[5]基于CRISPR/Cas9技术的果蝇基因组编辑研究[D]. 李萌琪.浙江大学 2017
[6]多肽信号编码基因CLE14调控拟南芥叶片衰老的功能研究[D]. 刘成.中国农业科学院 2015
[7]TALEN技术构建斑马鱼先天性心脏病gata4基因敲除模型的研究[D]. 刘静.北京协和医学院 2015
[8]定点编辑人jmjd3基因的TALEN质粒构建及jmjd3基因敲除对人宫颈癌细胞体外效应观察[D]. 陈美花.南昌大学医学院 2015
[9]利用TALEN技术对拟南芥EPSPS和SnRK2.2/2.3基因进行基因打靶的初步研究[D]. 陈荣荣.中国农业科学院 2014
[10]两种基因定点敲除技术TALEN和CRISPR在拟南芥中的应用[D]. 李苗苗.浙江大学 2014
本文编号：3616265
【文章来源】：西南大学重庆市211工程院校教育部直属院校
【文章页数】：74 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
基因编辑技术原理[1]
t被spacer序列相隔开。CRISPR通过spacer和靶标基因进行识别，储存和记录外源核酸入侵的信息。前导区位于CRISPR阵列前，和repeat序列相连，用于启动CRISPR的转录即前体crRNA（PrecursortranscriptRNA，pre-crRNA），而对应的反义链上的pre-crRNA也会经过转录和转录后加工，形成互补的反式激活crRNA（TransactivatingcrRNA，tracr-RNA）[71]。Cas是位于CRISPR附近的一种双链DNA核酸酶，和tracr-RNA和crRNA形成复合物，在gRNA的引导作用下对CRISPR识别的靶标位点切割，功能和FokI类似，但不需要形成二聚体来发挥功能。图1.2CRISPR/Cas的组成结构图[70]。Figure1.2CompositionofCRISPR/Cas[70].
西南大学硕士学位论文4CRISPR/Cas系统是细菌抵抗外界遗传物质入侵的自身免疫系统，可以在入侵的基因组中插入新的间隔序列；当相同的外源基因再次入侵时，会定向靶标切割外源基因，能够为细菌提供特异性的免疫保护。CRISPR/Cas系统的作用机制一般分三步[72]：（1）适应阶段，是cas蛋白识别获取spacer和其下游的前间区序列邻近基序（Protospaceradjacentmotif，PAM）序列的过程，而且各个CRISPR/Cas系统的PAM也不一样。当外源基因入侵时，Cas蛋白识别剪切spacer并插入到leader序列和其相邻repeat序列中间，从而组成新的spacer序列。以防相同的外源基因入侵时，能对其基因组剪切，阻断其复制和表达。（2）表达阶段，是crRNA的加工和成熟过程。leader序列启动CRISPR序列的转录，转录后形成的长链RNA为pre-crRNA，随后被相关Cas蛋白加工剪切成成熟的含单一spacer的crRNA，并且crRNA序列是和靶标基因互补的。（3）免疫干扰，成熟的crRNA能够和Cas蛋白等组成复合物，从而引导Cas蛋白对外源基因的剪切。并且不同的CRISPR系统的复合物也不同（图1.3）。图1.3CRISPR/Cas系统分子机制[72]。Figure1.3MolecularmechanismofCRISPR/Cassystem[72].1.2.2CRISPR/Cas系统的分类Cas蛋白作为CRISPR相关蛋白，一般情况下每种CRISPR/Cas系统包含4~10个Cas基因串联组成[73]。根据Cas基因数目和序列的不同，将CRISPR/Cas系统分为2个类型：Class1和2[74,75]。第1类CRISPR/Cas系统分为I型标签基因为Cas3、
【参考文献】：
期刊论文
[1]CRISPR/Cas9技术构建Vegf-b敲除斑马鱼模型和心血管发育异常的初探[J]. 宋来思,赵海山,吴文富,冯启荣,谭文. 广东药科大学学报. 2020(02)
[2]利用CRISPR/Cpf1系统构建稳定敲除LncRNA458314的肾癌细胞株及其功能探讨[J]. 周洋,陈兵海,王诚悦. 江苏大学学报(医学版). 2020(01)
[3]Construction of a One-Vector Multiplex CRISPR/Cas9 Editing System to Inhibit Nucleopolyhedrovirus Replication in Silkworms[J]. Zhanqi Dong,Qi Qin,Zhigang Hu,Peng Chen,Liang Huang,Xinling Zhang,Ting Tian,Cheng Lu,Minhui Pan. Virologica Sinica. 2019(04)
[4]利用CRISPR/Cas9技术产生肌肉特异表达Cas9的小鼠胚胎[J]. 李昊,陈胜男,李松美,朴善花,安铁洙,王春生. 中国实验动物学报. 2019(03)
[5]利用TALEN技术编辑水稻光温敏核不育基因PMS3[J]. 林艳,刘华清,付艳萍,吴明基. 福建农业学报. 2019(04)
[6]基因编辑技术原理及其在动植物研究中的应用[J]. 张泗举,栾维江. 天津师范大学学报(自然科学版). 2019(03)
[7]CRISPR家族新成员:CRISPR-Cpf1[J]. 周晨晨,刘写写,谢海华,谷峰. 生物化学与生物物理进展. 2018(06)
[8]CRISPR/Cas系统抵御细菌耐药[J]. 徐艳,崔玉晓,杨洋,罗义,郑向群,毛大庆. 生态毒理学报. 2018(03)
[9]谷氨酸棒状杆菌CRISPR-Cpf1和Cre/loxP基因敲除技术的比较[J]. 占米林,阚宝军,张辉,董晋军,许国超,韩瑞枝,倪晔. 微生物学通报. 2019(02)
[10]类转录激活因子效应物核酸酶介导的E-cad和Bmi-1基因联合干预鼻咽癌的体外研究[J]. 罗婷婷,严爱芬,刘连,蒋泓,冯翠兰,刘冠男,刘芳,唐冬生,周天鸿. 中南大学学报(医学版). 2018(03)
博士论文
[1]CRISPR/Cas9基因敲除技术在家蚕基因功能研究中的应用[D]. 辛虎虎.浙江大学 2015
[2]基于基因组编辑的家蚕丝腺遗传改良与应用研究[D]. 马三垣.西南大学 2014
[3]靶向HPV E6E7基因的TALEN的构建及应用研究[D]. 丁文成.华中科技大学 2014
硕士论文
[1]利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建Ndufs4基因敲除小鼠和STRA8-eGFP转基因小鼠的研究[D]. 吴汗.南方医科大学 2018
[2]使用CRISPR/Cas诱导淋巴细胞中CCR5基因突变为CCR5Δ32的研究[D]. 齐春侠.南开大学 2017
[3]Talen介导的SP110基因定位整合于PRNP基因位点的抗结核、抗瘙痒病羊的研制[D]. 吉小芳.扬州大学 2017
[4]利用TALEN技术定点突变水稻DST基因[D]. 罗伟锋.黑龙江大学 2017
[5]基于CRISPR/Cas9技术的果蝇基因组编辑研究[D]. 李萌琪.浙江大学 2017
[6]多肽信号编码基因CLE14调控拟南芥叶片衰老的功能研究[D]. 刘成.中国农业科学院 2015
[7]TALEN技术构建斑马鱼先天性心脏病gata4基因敲除模型的研究[D]. 刘静.北京协和医学院 2015
[8]定点编辑人jmjd3基因的TALEN质粒构建及jmjd3基因敲除对人宫颈癌细胞体外效应观察[D]. 陈美花.南昌大学医学院 2015
[9]利用TALEN技术对拟南芥EPSPS和SnRK2.2/2.3基因进行基因打靶的初步研究[D]. 陈荣荣.中国农业科学院 2014
[10]两种基因定点敲除技术TALEN和CRISPR在拟南芥中的应用[D]. 李苗苗.浙江大学 2014
本文编号：3616265
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