非生物胁迫下拟南芥AtSIS基因的功能研究

发布时间：2022-02-20 23:46

　　各种非生物胁迫严重影响着植物的生长发育,目前已揭示了植物多种抵抗逆境胁迫的分子机制,固有无序蛋白在其中发挥着重要作用。AtSIS编码固有无序蛋白,参与植物对逆境胁迫的响应,但其具体功能未知。本文通过原核表达、质谱鉴定目标蛋白,应用生物信息学软件预测AtSIS蛋白的空间结构;构建pCsGFPBT-AtSIS、AtSIS-pCCFP植物表达载体,分析AtSIS蛋白在非生物胁迫条件下的亚细胞定位;在拟南芥发芽期、幼苗期和抽苔期,对AtSIS的缺失突变体、过表达体和野生型分别进行盐、干旱、高温、低温、外源ABA和H₂O₂胁迫处理,通过检测表型、生理指标以及AtSIS和相关基因转录的变化,分析了AtSIS在不同非生物胁迫下的功能。主要研究结果如下:构建原核表达载体AtSIS-pET22b,经诱导表达分离纯化得到两条与目的蛋白大小相似的条带,质谱鉴定确定两条带均为AtSIS。利用SOPMA、SSpro软件预测,AtSIS二级结构的主要类型为无规卷曲,不能形成稳定的三级结构,确证AtSIS为固有无序蛋白质。通过激光共聚焦显微镜检测发现,正常生长条件下,At... 

【文章来源】：哈尔滨师范大学黑龙江省

【文章页数】：141 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
第1章 绪论
    1.1 固有无序蛋白质
        1.1.1 结构特征
        1.1.2 亚细胞定位
    1.2 植物对非生物胁迫应答研究进展
        1.2.1 植物对盐胁迫的响应
        1.2.2 植物对干旱胁迫的响应
        1.2.3 植物对高温和低温胁迫的响应
        1.2.4 植物对氧化胁迫的响应
        1.2.5 非生物胁迫下ABA介导的气孔运动
    1.3 非生物胁迫下植物基因的表达调控
        1.3.1 ABA信号通路及生物合成
        1.3.2 非生物胁迫下ABA依赖及ABA非依赖基因的表达调控
    1.4 存在问题与发展趋势
    1.5 本研究的目的和意义
    1.6 研究的技术路线
第2章 AtSIS原核表达及结构分析
    2.1 实验材料和仪器
        2.1.1 载体和菌株
        2.1.2 实验试剂
        2.1.3 实验仪器
    2.2 实验方法
        2.2.1 At SIS基因CDS序列密码子优化
        2.2.2 原核表达载体At SIS-p ET22b的构建
        2.2.3 At SIS的诱导、纯化及SDS-PAGE电泳检测
        2.2.4 蛋白质质谱鉴定
        2.2.5 AtSIS蛋白质二级结构及三级结构预测
    2.3 结果分析
        2.3.1 加入酶切位点的At SIS基因及p ET22b载体的获得
        2.3.2 At SIS-p ET22b转 DH5α的菌落PCR及酶切鉴定
        2.3.3 测序结果序列比对
        2.3.4 At SIS-p ET22b转 BL21 表达菌株的菌落PCR鉴定
        2.3.5 AtSIS的诱导表达及纯化结果分析
        2.3.6 质谱鉴定结果分析
        2.3.7 AtSIS蛋白质结构分析
    2.4 讨论
    2.5 小结
第3章 AtSIS在拟南芥中的亚细胞定位分析
    3.1 实验材料和仪器
        3.1.1 植物材料
        3.1.2 载体和菌株
        3.1.3 实验试剂
        3.1.4 实验仪器
    3.2 实验方法
        3.2.1 克隆载体的构建
        3.2.2 植物表达载体的构建
        3.2.3 农杆菌转化拟南芥植株
        3.2.4 转基因拟南芥的筛选及分子鉴定
        3.2.5 种子的消毒和播种
        3.2.6 AtSIS亚细胞定位观察
    3.3 结果分析
        3.3.1 p MD18-At SIS菌落PCR鉴定
        3.3.2 测序结果及分析
        3.3.3 表达载体菌落PCR及酶切鉴定
        3.3.4 转基因拟南芥的分子鉴定
        3.3.5 AtSIS的亚细胞定位
    3.4 讨论
    3.5 小结
第4章 AtSIS对渗透胁迫的功能分析
    4.1 实验材料和仪器
        4.1.1 植物材料
        4.1.2 实验试剂
        4.1.3 实验仪器
    4.2 实验方法
        4.2.1 拟南芥不同生长时期的胁迫处理
        4.2.2 蒸腾失水速率测定
        4.2.3 拟南芥气孔密度及开度测定
        4.2.4 超氧化物歧化酶(SOD)活性测定
        4.2.5 过氧化物酶(POD)活性测定
        4.2.6 丙二醛(MDA)含量测定
        4.2.7 拟南芥At SIS基因及相关基因的q RT-PCR检测
    4.3 结果与分析
        4.3.1 渗透胁迫下拟南芥生长形态指标分析
        4.3.2 渗透胁迫下拟南芥生理特性分析
        4.3.3 渗透胁迫下拟南芥基因表达调控分析
    4.4 讨论
    4.5 小结
第5章 At SIS对外源ABA和氧化胁迫的功能分析
    5.1 实验材料和仪器
        5.1.1 植物材料
        5.1.2 实验试剂
        5.1.3 实验仪器
    5.2 实验方法
        5.2.1 拟南芥不同生长时期的胁迫处理
        5.2.2 拟南芥气孔开度测定
        5.2.3 超氧化物歧化酶(SOD)活性测定
        5.2.4 过氧化物酶(POD)活性测定
        5.2.5 丙二醛(MDA)含量测定
        5.2.6 拟南芥At SIS基因及相关基因的q RT-PCR检测
    5.3 结果与分析
        5.3.1 外源ABA和氧化胁迫下拟南芥生长形态指标分析
        5.3.2 外源ABA和氧化胁迫下拟南芥生理特性分析
        5.3.3 外源ABA和氧化胁迫下拟南芥基因表达调控分析
    5.4 讨论
    5.5 小结
结论
参考文献
攻读硕士学位期间所发表的学术论文
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]植物内源ABA水平的动态调控机制[J]. 陈唯,曾晓贤,谢楚萍,田长恩,周玉萍.  植物学报. 2019(06)
[2]植物NAC转录因子的生物学功能[J]. 张慧珍,白雪芹,曾幼玲.  植物生理学报. 2019(07)
[3]干旱胁迫下植物体内活性氧的作用机制[J]. 王福祥,肖开转,姜身飞,曲梦宇,连玲,何炜,陈丽萍,谢华安,张建福.  科学通报. 2019(17)
[4]蛋白质翻译后修饰在ABA信号转导中的作用[J]. 张静,侯岁稳.  植物学报. 2019(03)
[5]高温胁迫对植物生理影响的研究进展[J]. 解玉玲.  吉林农业. 2019(08)
[6]活性氧在植物非生物胁迫响应中功能的研究进展[J]. 李格,孟小庆,蔡敬,董婷婷,李宗芸,朱明库.  植物生理学报. 2018(06)
[7]厚藤ASR基因克隆及功能初步分析[J]. 张会,郑洁旋,简曙光,夏快飞,张美.  植物科学学报. 2018(03)
[8]植物非生物胁迫信号转导及应答[J]. 朱健康,倪建平.  中国稻米. 2016(06)
[9]ABA信号通路的起源与进化[J]. 刘维仲,李林艳,胡勇.  中国生物化学与分子生物学报. 2016(08)
[10]固有无序蛋白质及逆境胁迫下的分子功能[J]. 王东艳,崔继哲,张隽.  中国生物化学与分子生物学报. 2015(09)

硕士论文
[1]利用T-DNA插入突变体研究逆境胁迫下AtSIS的作用[D]. 张隽.哈尔滨师范大学 2015
[2]固有无序蛋白At1g13930及对逆境胁迫的应答[D]. 王东艳.哈尔滨师范大学 2015



本文编号：3636052