CRISPR/Cas9体外酶切检测猪生长抑素基因定点修饰靶点活性的研究

发布时间：2022-02-21 00:09

　　本试验旨在通过CRISPR/Cas9体外酶切法检测猪生长抑素（SST）基因定点修饰靶点的活性。试验设计5个长20bp的单链导向RNA（sgRNA）,即SST-sgRNA-g1、SST-sgRNA-g2、SST-sgRNA-g3、SST-sgRNA-g4和SST-sgRNA-g5。化学合成sgRNA寡核苷酸序列,将寡核苷酸序列连接到可同时表达Cas9和sgRNA的质粒中,挑选正确克隆的质粒作为模板进行体外转录形成SST-sgRNA。利用CRISPR/Cas9体外酶切含靶点的DNA片段,根据酶切条带的灰度换算成sgRNA活性。结果显示目的sgRNA寡核苷酸双链成功插入到质粒中且序列正确,以质粒为模板体外转录SST-sgRNA成功。靶位点经Cas9蛋白酶切后与标准sgRNA1和sgRNA2酶切活性作比较,确定靶点SST-sgRNA-g1、SST-sgRNA-g4和SST-sgRNA-g5活性较高,可为在细胞水平、胚胎水平做基因定点修饰提供依据。 

【文章来源】：中国畜牧兽医. 2016,43(01)北大核心

【文章页数】：8 页

【文章目录】：
1 材料与方法
    1.1 材料
    1.2 sgRNA靶点选择及其寡核苷酸链的合成
    1.3 sgRNA表达质粒构建及鉴定
    1.4 sgRNA靶位点活性检测
        1.4.1 sgRNA PCR产物的获得
        1.4.2 sgRNA体外转录
        1.4.3 sgRNA的回收和提取
        1.4.4酶切DNA的获得
        1.4.5 CRISPR/Cas9体外酶切
2 结果与分析
    2.1 sgRNA表达质粒测序结果
    2.2 sgRNA体外转录结果
    2.3 sgRNA重组质粒载体活性检测
3 讨论


【参考文献】：
期刊论文
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[2]CRISPR-Cas介导的基因编辑工具[J]. 左其生,李东,张亚妮,李碧春.  生物技术通报. 2014(07)
[3]通过CRISPR/Cas9系统敲除人源PDE10A基因[J]. 梁振伟,饶书权,沈岩,许琪.  基础医学与临床. 2014(04)
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[9]生长抑素及其受体的研究进展[J]. 江青东,王艳玲,王月影.  动物医学进展. 2005(06)
[10]生长抑素调控技术在畜牧业中的研究及应用[J]. 官琼,朱崇淼,季伟.  福建畜牧兽医. 2005(02)



本文编号：3636091