植物PME基因家族的分析及白菜PME37c的功能鉴定
发布时间：2022-02-22 13:23
花粉发育是植物有性生殖的重要一环,花粉壁的正常发育对于花粉形态和功能的维持尤为重要。花粉内壁主要由果胶等组成,果胶的合成和修饰过程若有异常,则会直接影响内壁的发育,进而造成花粉萌发及花粉管生长等异常。果胶甲酯酶（pectinmethylesterase,PME）是果胶侧链的一种重要修饰酶,已有研究表明,在拟南芥和白菜中,有数个PME基因参与花粉内壁的形成。拟南芥中至少有15个PME参与花粉发育,白菜中也有20多个PME与花粉发育相关,但其中绝大部分PME基因的具体功能还不清楚。研究白菜基因功能的传统方法主要有诱变、反义干涉、RNA干涉、过表达等,但由于白菜在进化过程中经历了一次全基因组三倍化事件,导致其基因组内同源基因比较多,上述方法在实际应用过程中存在很多局限。新兴的CRISPR/Cas9基因编辑技术可以很好地解决这些问题,但白菜中尚未建立起成熟的CRISPR/Cas9体系。本文首先通过生物信息学的方法对白菜等九种植物的PME基因家族成员进行鉴定,再结合网上公布的转录组数据对这些PME基因进行表达分析;然后找出各个植物中花发育特异或优势表达的PME,对其进行序列比对和启动子顺式作用元...
【文章来源】：浙江大学浙江省211工程院校985工程院校教育部直属院校
【文章页数】：126 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
致谢
缩略词
摘要
Abstract
前言
1 文献综述
1.1 花粉内壁的发育
1.1.1 花粉发育
1.1.2 成熟花粉壁的结构
1.1.3 花粉壁发育过程
1.1.4 参与花粉内壁发育的基因
1.1.4.1 纤维素合成相关基因
1.1.4.2 果胶合成相关基因
1.1.4.3 果胶侧链修饰相关基因
1.1.4.4 花粉壁结构蛋白相关基因
1.1.4.5 其他基因
1.2 PME基因的研究进展
1.2.1 PME蛋白的结构
1.2.2 PME蛋白的性质
1.2.3 PME蛋白的作用模式
1.2.4 PME蛋白的抑制子
1.2.5 PME基因在植物生长发育中的功能
1.2.5.1 PME基因在营养生长过程中的功能
1.2.5.2 PME基因在生殖生长过程中的功能
1.3 CRISPR/Cas9基因编辑技术在植物基因组编辑中的应用
1.3.1 CRISPR/Cas9系统简介
1.3.2 CRISPR/Cas9基因编辑技术在植物中的应用
1.3.3 CRISPR/Cas9体系被广泛用于植物基因组编辑
1.3.4 在植物中应用CRISPR/Cas9基因编辑技术的流程
1.3.5 CRISPR/Cas9基因编辑技术存在脱靶及其他问题
1.3.6 提高CRISPR/Cas9靶向效率的策略
1.3.7 获得不含T-DNA的突变体的方法
2 白菜等九种植物PME基因家族的鉴定及花发育相关PME的分析
2.1 材料与方法
2.1.1 植物材料和试剂耗材
2.1.2 植物基因组、基因表达数据及其他生物信息学工具
2.1.3 PME基因家族成员的鉴定
2.1.4 基因表达数据获取及处理
2.1.5 总RNA的提取及cDNA合成
2.1.6 白菜PME基因家族qRT-PCR分析
2.1.7 花发育相关PME启动子序列获取及分析
2.2 结果
2.2.1 白菜等九种植物的PME基因家族成员都较多
2.2.2 白菜等九种植物709个PME可分为五类
2.2.3 PME家族基因的表达分析
2.2.4 白菜PME基因表达验证
2.2.5 花序特异或优势表达的PME分析
2.3 讨论
2.3.1 在高等植物中PME基因家族成员都比较多
2.3.2 众多PME基因参与花序的发育
2.3.3 不同植物参与花序发育的PME在序列上高度保守
3 白菜和拟南芥花粉发育相关的四个PME基因序列与表达分析
3.1 材料与方法
3.1.1 植物材料、载体、菌种与主要试剂
3.1.2 DNA、RNA的提取与cDNA的合成
3.1.3 DNA和CDS的克隆
3.1.4 核酸和蛋白序列分析
3.1.5 实时荧光定量分析(qRT-PCR)
3.1.6 启动子融合表达
3.1.6.1 载体构建及农杆菌转化
3.1.6.2 拟南芥浸花转化及转基因植株筛选
3.1.6.3 启动子融合表达载体转基因拟南芥的观察
3.1.7 亚细胞定位
3.1.7.1 亚细胞定位载体构建
3.1.7.2 洋葱表皮瞬时转化
3.1.7.3 亚细胞定位观察
3.2 结果
3.2.1 BcPME37a、BcPME37b、BcPME37c和AtPME37的启动子、核酸和蛋白质序列分析
3.2.2 BcPME37a、BcPME37b、BcPME37c和AtPME37在花粉中优势或特异表达
3.2.3 表明BcPME37c在花发育晚期表达量较高
3.2.4 BcPME37c的编码蛋白定位于细胞壁
3.3 讨论
3.3.1 BcPME37a、BcPME37b和AtPME37的功能可能相似
3.3.2 BcPME37c可能参与成熟花粉的发育和花粉萌发等过程
3.3.3 BcPME37a、BcPME37b和BcPME37c的功能可能有分化
4 白菜CRISPR/Cas9基因编辑体系的建立
4.1 材料与方法
4.1.1 植物材料、载体、菌株、主要试剂及常用培养基配方
4.1.2 sgRNA的设计、合成及退火
4.1.3 CRISPR/Cas9载体的构建
4.1.4 sgRNA-Cas9-121载体对菜心的遗传转化
4.1.5 基因组DNA的提取
4.1.6 阳性芽及突变类型鉴定
4.1.7 T-DNA插入片段检测
4.1.8 脱靶检测
4.2 结果
4.2.1 克隆得到Bra003491、Bra007665和Bra014410基因DNA序列和CDS
4.2.2 构建了单靶点载体并转化菜心得到突变体
4.2.3 构建了多靶点载体并转化菜心得到突变体
4.2.4 CRISPR/Cas9引起的白菜基因突变可以稳定地遗传到T_1代和T_2代
4.2.5 得到了不含T-DNA的Bra003491突变体
4.2.6 在白菜突变体中未检测到脱靶效应
4.3 讨论
4.3.1 高效菜心CRISPR/Cas9体系的建立
4.3.2 多靶点载体在菜心中实现大片段敲除
4.3.3 多靶点载体在菜心中实现两个基因的同时编辑
4.3.4 少数碱基的插入和缺失突变造成蛋白质移码突变或者翻译提早结束
4.3.5 T_0代的突变可以稳定遗传给后代
4.3.6 通过自交可以得到不含T-DNA的突变体
4.3.7 三条sgRNA在菜心中没有脱靶
5 BcPME37c在白菜花粉发育中的功能鉴定
5.1 材料与方法
5.1.1 植物材料和主要试剂耗材
5.1.2 敲除突变体的形态学观察
5.1.3 花粉活力检测
5.1.4 花粉直径测量
5.1.5 花粉苯胺蓝染色
5.1.6 花粉DAPI染色
5.1.7 花粉形态扫描电镜观察
5.1.8 花粉切片透射电镜观察
5.1.9 结籽率统计
5.2 结果
5.2.1 bcpme37c营养生长及四轮花器官的形态均正常
5.2.2 bcpme37c部分花粉吸胀后直径明显增大
5.2.3 BcPME37c突变后不影响花粉核的分裂及胼胝质的降解
5.2.4 bcpme37c部分花粉形态异常
5.2.5 bcpme37c成熟花粉内壁异常加厚
5.2.6 bcpme37c结籽正常
5.3 讨论
5.3.1 BcPME37c可能通过调控内壁HG的甲酯化程度来影响内壁的建构
5.3.2 bcpme37c表型不太明显可能是基因功能冗余导致
结论
参考文献
附录
附录1 附表和附图
附录2 常用试剂和培养基配方
在读期间发表的论文
本文编号：3639530
【文章来源】：浙江大学浙江省211工程院校985工程院校教育部直属院校
【文章页数】：126 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
致谢
缩略词
摘要
Abstract
前言
1 文献综述
1.1 花粉内壁的发育
1.1.1 花粉发育
1.1.2 成熟花粉壁的结构
1.1.3 花粉壁发育过程
1.1.4 参与花粉内壁发育的基因
1.1.4.1 纤维素合成相关基因
1.1.4.2 果胶合成相关基因
1.1.4.3 果胶侧链修饰相关基因
1.1.4.4 花粉壁结构蛋白相关基因
1.1.4.5 其他基因
1.2 PME基因的研究进展
1.2.1 PME蛋白的结构
1.2.2 PME蛋白的性质
1.2.3 PME蛋白的作用模式
1.2.4 PME蛋白的抑制子
1.2.5 PME基因在植物生长发育中的功能
1.2.5.1 PME基因在营养生长过程中的功能
1.2.5.2 PME基因在生殖生长过程中的功能
1.3 CRISPR/Cas9基因编辑技术在植物基因组编辑中的应用
1.3.1 CRISPR/Cas9系统简介
1.3.2 CRISPR/Cas9基因编辑技术在植物中的应用
1.3.3 CRISPR/Cas9体系被广泛用于植物基因组编辑
1.3.4 在植物中应用CRISPR/Cas9基因编辑技术的流程
1.3.5 CRISPR/Cas9基因编辑技术存在脱靶及其他问题
1.3.6 提高CRISPR/Cas9靶向效率的策略
1.3.7 获得不含T-DNA的突变体的方法
2 白菜等九种植物PME基因家族的鉴定及花发育相关PME的分析
2.1 材料与方法
2.1.1 植物材料和试剂耗材
2.1.2 植物基因组、基因表达数据及其他生物信息学工具
2.1.3 PME基因家族成员的鉴定
2.1.4 基因表达数据获取及处理
2.1.5 总RNA的提取及cDNA合成
2.1.6 白菜PME基因家族qRT-PCR分析
2.1.7 花发育相关PME启动子序列获取及分析
2.2 结果
2.2.1 白菜等九种植物的PME基因家族成员都较多
2.2.2 白菜等九种植物709个PME可分为五类
2.2.3 PME家族基因的表达分析
2.2.4 白菜PME基因表达验证
2.2.5 花序特异或优势表达的PME分析
2.3 讨论
2.3.1 在高等植物中PME基因家族成员都比较多
2.3.2 众多PME基因参与花序的发育
2.3.3 不同植物参与花序发育的PME在序列上高度保守
3 白菜和拟南芥花粉发育相关的四个PME基因序列与表达分析
3.1 材料与方法
3.1.1 植物材料、载体、菌种与主要试剂
3.1.2 DNA、RNA的提取与cDNA的合成
3.1.3 DNA和CDS的克隆
3.1.4 核酸和蛋白序列分析
3.1.5 实时荧光定量分析(qRT-PCR)
3.1.6 启动子融合表达
3.1.6.1 载体构建及农杆菌转化
3.1.6.2 拟南芥浸花转化及转基因植株筛选
3.1.6.3 启动子融合表达载体转基因拟南芥的观察
3.1.7 亚细胞定位
3.1.7.1 亚细胞定位载体构建
3.1.7.2 洋葱表皮瞬时转化
3.1.7.3 亚细胞定位观察
3.2 结果
3.2.1 BcPME37a、BcPME37b、BcPME37c和AtPME37的启动子、核酸和蛋白质序列分析
3.2.2 BcPME37a、BcPME37b、BcPME37c和AtPME37在花粉中优势或特异表达
3.2.3 表明BcPME37c在花发育晚期表达量较高
3.2.4 BcPME37c的编码蛋白定位于细胞壁
3.3 讨论
3.3.1 BcPME37a、BcPME37b和AtPME37的功能可能相似
3.3.2 BcPME37c可能参与成熟花粉的发育和花粉萌发等过程
3.3.3 BcPME37a、BcPME37b和BcPME37c的功能可能有分化
4 白菜CRISPR/Cas9基因编辑体系的建立
4.1 材料与方法
4.1.1 植物材料、载体、菌株、主要试剂及常用培养基配方
4.1.2 sgRNA的设计、合成及退火
4.1.3 CRISPR/Cas9载体的构建
4.1.4 sgRNA-Cas9-121载体对菜心的遗传转化
4.1.5 基因组DNA的提取
4.1.6 阳性芽及突变类型鉴定
4.1.7 T-DNA插入片段检测
4.1.8 脱靶检测
4.2 结果
4.2.1 克隆得到Bra003491、Bra007665和Bra014410基因DNA序列和CDS
4.2.2 构建了单靶点载体并转化菜心得到突变体
4.2.3 构建了多靶点载体并转化菜心得到突变体
4.2.4 CRISPR/Cas9引起的白菜基因突变可以稳定地遗传到T_1代和T_2代
4.2.5 得到了不含T-DNA的Bra003491突变体
4.2.6 在白菜突变体中未检测到脱靶效应
4.3 讨论
4.3.1 高效菜心CRISPR/Cas9体系的建立
4.3.2 多靶点载体在菜心中实现大片段敲除
4.3.3 多靶点载体在菜心中实现两个基因的同时编辑
4.3.4 少数碱基的插入和缺失突变造成蛋白质移码突变或者翻译提早结束
4.3.5 T_0代的突变可以稳定遗传给后代
4.3.6 通过自交可以得到不含T-DNA的突变体
4.3.7 三条sgRNA在菜心中没有脱靶
5 BcPME37c在白菜花粉发育中的功能鉴定
5.1 材料与方法
5.1.1 植物材料和主要试剂耗材
5.1.2 敲除突变体的形态学观察
5.1.3 花粉活力检测
5.1.4 花粉直径测量
5.1.5 花粉苯胺蓝染色
5.1.6 花粉DAPI染色
5.1.7 花粉形态扫描电镜观察
5.1.8 花粉切片透射电镜观察
5.1.9 结籽率统计
5.2 结果
5.2.1 bcpme37c营养生长及四轮花器官的形态均正常
5.2.2 bcpme37c部分花粉吸胀后直径明显增大
5.2.3 BcPME37c突变后不影响花粉核的分裂及胼胝质的降解
5.2.4 bcpme37c部分花粉形态异常
5.2.5 bcpme37c成熟花粉内壁异常加厚
5.2.6 bcpme37c结籽正常
5.3 讨论
5.3.1 BcPME37c可能通过调控内壁HG的甲酯化程度来影响内壁的建构
5.3.2 bcpme37c表型不太明显可能是基因功能冗余导致
结论
参考文献
附录
附录1 附表和附图
附录2 常用试剂和培养基配方
在读期间发表的论文
本文编号：3639530
本文链接：https://www.wllwen.com/kejilunwen/jiyingongcheng/3639530.html
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