下调ACAT1基因表达对NKG2D-CAR-T细胞抗结直肠癌作用影响的研究

发布时间：2022-02-22 14:35

　　CAR-T（Chimeric Antigen Receptor T）细胞疗法自发展之初至今已有30多年的历史,该疗法在人类的抗癌史中具有里程碑式的意义。现今各种CAR-T细胞疗法及相关研究正在如火如荼地进行,研究者们正致力于解决CAR-T细胞治疗中遇到的各项挑战。众多研究中,ACAT1基因的相关功能引起了人们的关注。ACAT1参与编码胆固醇酯化酶,胆固醇酯化酶能够将胆固醇转化为胆固醇酯,调节细胞内的胆固醇水平,进而影响细胞的效应功能。因此,本课题在NKG2D-CAR-T细胞疗法的基础上,进一步研究下调ACAT1基因表达对于NKG2D-CAR-T细胞抗结直肠癌细胞的能力及相关生物学特性的影响。首先,使用本实验室已构建的质粒用于包装慢病毒。从健康人外周血中分离出T细胞,用浓缩的病毒感染T细胞,感染效率达到90%以上。利用Q-PCR、Western Blot对shRNA干扰ACAT1基因的表达效率进行检测,发现ACAT1基因表达被下调了约50%。用效应细胞杀伤结直肠癌细胞（HCT-8）,随着效靶比的升高,shACAT1-NKG2D-CAR-T细胞抗结直肠癌的作用不断提升,证明下调ACAT1基... 

【文章来源】：华东师范大学上海市211工程院校985工程院校教育部直属院校

【文章页数】：90 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
abstract
第一章 绪论
    1.1 CAR-T细胞疗法
        1.1.1 概述
        1.1.2 CAR-T细胞疗法研究进展
        1.1.3 CAR-T的分子结构及作用原理
        1.1.4 CAR-T细胞疗法现存的问题及解决方案
    1.2 结直肠癌
        1.2.1 概述
        1.2.2 结直肠癌治疗
    1.3 NKG2D靶向
        1.3.1 NKG2D与其配体
        1.3.2 NKG2D-CAR的相关应用
    1.4 胆固醇
        1.4.1 胆固醇简介
        1.4.2 胆固醇与胆固醇酰基转移酶1的关系
    1.5 RNA干扰技术
        1.5.1 RNA干扰技术的研究进展及应用
        1.5.2 RNA干扰技术的系统组成和作用原理
        1.5.3 RNA干扰技术的特性
    1.6 研究思路与目标
第二章 ACAT1低表达NKG2D-CAR-T细胞的制备及检测
    2.1 引言
    2.2 实验材料
        2.2.1 细胞株
        2.2.2 慢病毒质粒
        2.2.3 常用实验试剂
        2.2.4 常用实验试剂配制方法
        2.2.5 常用实验仪器
        2.2.6 常用实验耗材
    2.3 实验方法
        2.3.1 转化、小提质粒并酶切鉴定
        2.3.2 制备三种慢病毒并测定滴度
        2.3.3 制备CAR-T细胞
        2.3.4 检测sh RNA-ACAT1干扰效果
    2.4 实验结果
        2.4.1 小提质粒酶切鉴定
        2.4.2 三种慢病毒滴度
        2.4.3 CAR-T细胞阳性率
        2.4.4 shRNA-ACAT1干扰效果
    2.5 讨论
    2.6 小结
第三章 下调ACAT1基因表达对于NKG2D-CAR-T细胞效应功能的影响
    3.1 引言
    3.2 实验材料
        3.2.1 细胞
        3.2.2 常用实验试剂
        3.2.3 常用实验试剂配制方法
        3.2.4 常用实验仪器及耗材
    3.3 实验方法
        3.3.1 检测MICA/B在 HCT-8 细胞上的表达
        3.3.2 流式检测CRA-T细胞的细胞毒性作用
        3.3.3 检测CAR-T细胞活化、脱颗粒水平
        3.3.4 检测CAR-T细胞中干扰素γ(IFN-γ)、颗粒酶B(GzmB)的表达水平
    3.4 实验结果
        3.4.1 MICA/MICB在 HCT-8 细胞中高水平表达
        3.4.2 下调ACAT1基因表达增强了NKG2D-CAR-T细胞的细胞毒性作用
        3.4.3 下调ACAT1基因表达增强了NKG2D-CAR-T细胞激活、脱颗粒水平
        3.4.4 下调基因表达提高了NKG2D-CAR-T细胞的干扰素γ、颗粒酶B的释放
    3.5 讨论
    3.6 小结
第四章 下调ACAT1基因表达对CAR-T细胞耗竭、增殖、分化的影响
    4.1 引言
    4.2 实验材料
        4.2.1 细胞
        4.2.2 常用实验试剂
        4.2.3 常用实验试剂配制方法
        4.2.4 常用实验仪器及耗材
    4.3 实验方法
        4.3.1 检测CAR-T细胞的耗竭
        4.3.2 检测CAR-T细胞的增殖情况
        4.3.3 检测CAR-T细胞的分化情况
    4.4 实验结果
        4.4.1 下调ACAT1基因表达降低CAR-T细胞的耗竭
        4.4.2 下调ACAT1基因表达促进CAR-T细胞的增殖
        4.4.3 下调ACAT1基因表达影响CAR-T细胞的分化
    4.5 讨论
    4.6 小结
第五章 全文总结与展望
参考文献
附录
后记



本文编号：3639646