在液体静置培养中整合透明颤菌血红蛋白基因表达和钙离子添加策略进一步提高灵芝中单体灵芝酸的积累

发布时间：2022-04-25 21:08

　　灵芝酸是灵芝产的一种有30个碳原子的四环三萜类化合物,研究表明灵芝酸具有抗HIV和抗肿瘤等多种药理学活性。灵芝酸具有两种不同的化学结构。其中,Ⅰ型灵芝酸的羊毛甾醇骨架上只有一个单双键结构,而Ⅱ型灵芝酸的羊毛甾醇骨架上含有两个共轭双键。目前,菌丝体液体培养灵芝细胞是一种可以有效生产灵芝酸的方法。由于液体培养灵芝细胞生产的灵芝酸产量较低,限制了灵芝酸的商业化生产和临床应用,因此进一步提高灵芝中灵芝酸的产量具有重要意义。本文中,我们将整合发酵策略和基因工程改造应用到了提高灵芝菌丝体发酵生产单体灵芝酸中。我们研究了在液体静置培养灵芝细胞中整合表达透明颤菌血红蛋白（VHb）和钙离子添加策略下灵芝酸的生物合成情况。结果显示,整合策略下五种单体灵芝酸GA-O,-Mk,-T,-S和-Me的最大产量分别为1451.33±67.50,179.66±5.06,1320.59±20.84,1431.23±79.74和1283.81±85.13?g/100 mg细胞干重,这些产量分别为静置培养条件下野生型菌株（对照）中各单体灵芝酸含量的2.66,2.50,2.52,3.50和5.98倍。整合策略下单体灵芝酸GA... 

【文章页数】：82 页

【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
第一章 绪论
    1.1 高等药用真菌
    1.2 灵芝及其生物活性成分
    1.3 灵芝酸结构、种类及其药理活性
    1.4 灵芝酸的生物合成
    1.5 灵芝酸的发酵生产
    1.6 整合发酵策略与基因工程在提高次级代谢产物产量中的应用
    1.7 灵芝酸的多样性
    1.8 立题的目的和意义
    1.9 本文的主要研究内容与技术路线
第二章 在VHb灵芝工程菌株中整合液体静置培养和钙离子添加策略对灵芝酸生物合成的影响
    2.1 引言
    2.2 材料与方法
        2.2.1 菌种及培养
        2.2.2 灵芝细胞生物量以及培养基中残糖的含量测定
        2.2.3 灵芝酸单体的提取与含量测定
        2.2.4 中间代谢产物鲨烯和羊毛甾醇的提取与检测
        2.2.5 灵芝酸生物合成相关基因hmgr,fps,sqs和cyp-5150l8表达水平的检测
        2.2.6 数据处理与分析方法
    2.3 实验结果
        2.3.1 静置培养条件下VHb的表达对灵芝酸产量的影响
        2.3.2 整合策略下灵芝酸的生物合成
        2.3.3 整合策略对中间代谢产物鲨烯和羊毛甾醇积累量的影响
        2.3.4 整合策略下灵芝酸生物合成相关基因hmgr,fps,sqs和cyp-5150l8表达水平
    2.4 讨论
    2.5 本章小结
第三章 静置培养条件下VHb表达对Ⅰ型与Ⅱ型灵芝酸分布的影响
    3.1 引言
    3.2 材料与方法
        3.2.1 静置培养条件下VHb表达对灵芝酸产量影响
        3.2.2 细胞色素P450基因A2,V2和A13表达水平的检测
        3.2.3 数据处理与分析方法
    3.3 实验结果
        3.3.1 静置培养条件下VHb表达对Ⅰ型和Ⅱ型灵芝酸比例的影响
        3.3.2 静置培养条件下VHb表达对P450基因A2,V2和A13转录水平的影响
    3.4 讨论
    3.5 本章小结
第四章 结论与展望
    4.1 全文结论
    4.2 展望
    4.3 文章创新点
致谢
参考文献
附录A 攻读硕士期间发表的论文
附录B 标准曲线


【参考文献】：
期刊论文
[1]灵芝三萜类化合物药理作用研究进展[J]. 罗俊,林志彬.  药学学报. 2002(07)
[2]灵芝三萜类成分在体内外对小鼠免疫性肝损伤的影响[J]. 王明宇,林志彬.  中国药学杂志. 2000(12)
[3]人工紫芝的抗炎镇痛作用研究[J]. 万阜昌,黄道斋.  中国中药杂志. 1992(10)

硕士论文
[1]抗肿瘤活性化合物灵芝酸T高效制备方法的研究[D]. 王家乐.上海交通大学 2011



本文编号：3648343