雌酮孕酮尿液代谢物基因工程抗体的筛选与鉴定

发布时间：2022-04-27 19:51

　　雌性激素包括雌激素与孕激素两大类,对女性发育和生殖功能至关重要。雌激素主要有雌酮、雌二醇和雌三醇,孕激素以孕酮为主。雌激素、孕激素水平是生殖监测中不可或缺的临床指标,性激素六项中就包含雌二醇和孕酮,对不孕症的病因诊断、疗效观察、预后判断及生殖生理作用机制的研究具有重要意义。国内外性激素常规检查方法以血清为样本,连续采血检测易引起病人心理压力,且存在安全风险,开发快速无创监测性激素水平方法有较大需求。近期研究发现,雌酮和孕酮的尿液代谢物,雌酮-3-葡糖苷酸（Estrone-3-glucuronide,E1G）和孕二醇-3-葡糖苷酸（Pregnanediol-3-glucuronide,PdG）浓度与血清雌酮孕酮浓度呈线性相关,使得通过尿液无创监控雌酮孕酮水平成为可能。但是E1G和PdG分子量低、免疫原性弱,是哺乳动物体内本身存在的代谢物,难以通过传统免疫方法稳定获得抗体,或高特异性和高亲和力抗体,成为此类检测产品开发的限制因素。随着基因工程和重组抗体技术的发展,第三代抗体尤其是抗原结合片段（Fragment antigen-binding,Fab）,在制备小分子抗原抗体中展现出巨大潜力。... 

【文章页数】：93 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
注释表
第一章 绪论
    1.1 雌激素与孕激素
        1.1.1 雌激素与孕激素的生理功能
        1.1.2 雌激素孕激素检测的临床指标和意义
        1.1.3 雌酮孕酮代谢物及其临床意义
        1.1.4 雌激素临床检测方法
    1.2 抗体
        1.2.1 抗体的结构
        1.2.2 抗体的识别
        1.2.3 抗体的制备
    1.3 基因工程抗体
        1.3.1 基因工程抗体种类
        1.3.2 Fab抗体及其应用
        1.3.3 基因工程抗体的制备与筛选
    1.4 噬菌体抗体库技术
        1.4.1 噬菌体展示技术
        1.4.2 噬菌体抗体库
        1.4.3 噬菌体抗体库技术的优势
    1.5 研究目的与研究内容
        1.5.1 研究目的及研究意义
        1.5.2 研究内容
        1.5.3 研究方法与技术路线
第二章 小鼠免疫与抗体Fab基因的扩增
    2.1 材料与试剂
        2.1.1 实验材料
        2.1.2 引物序列
        2.1.3 试剂
        2.1.4 溶液配制
        2.1.5 主要仪器设备
    2.2 实验方法
        2.2.1 小鼠的免疫
        2.2.2 抗体效价的动态监测
        2.2.3 脾细胞的分离
        2.2.4 总RNA的提取
        2.2.5 cDNA的合成
        2.2.6 SOE-PCR扩增Fab基因
    2.3 结果与分析
        2.3.1 抗体效价的测定
        2.3.2 总RNA的提取及反转录
        2.3.3 抗体基因的扩增
    2.4 讨论与小结
第三章 抗E1G、PdG的 Fab噬菌体抗体库的构建
    3.1 材料与试剂
        3.1.1 实验材料
        3.1.2 引物序列
        3.1.3 试剂及溶液配制
        3.1.4 主要仪器设备和耗材
    3.2 实验方法
        3.2.1 XL1-Blue电转感受态细胞的制备
        3.2.2 噬菌体抗体重组载体的构建
        3.2.3 Fab噬菌体抗体库的电转化
    3.3 结果与分析
        3.3.1 XL1-Blue感受态细胞的转化效率与污染测试结果
        3.3.2 Fab与 pComb3Xλ的酶切结果
        3.3.3 小体系连接测试结果
        3.3.4 Fab噬菌体抗体库的电转化
    3.4 讨论与小结
第四章 抗E1G、PdG的 Fab噬菌体抗体库的筛选
    4.1 材料与试剂
        4.1.1 实验材料
        4.1.2 试剂及溶液配制
        4.1.3 主要耗材
    4.2 实验方法
        4.2.1 辅助噬菌体的制备
        4.2.2 噬菌体抗体库的扩增
        4.2.3 噬菌体的纯化
        4.2.4 抗体库的淘选
        4.2.5 抗体库的第二轮扩增与淘选
    4.3 结果与分析
        4.3.1 VCSM13 辅助噬菌体的制备
        4.3.2 Fab噬菌体抗体库的淘选
    4.4 讨论与小结
第五章 抗E1G、PdG Fab抗体的分析与鉴定
    5.1 材料与试剂
    5.2 实验方法
        5.2.1 抗体片段的表达
        5.2.2 抗体片段ELISA
        5.2.3 DNA测序与序列分析
        5.2.4 间接竞争ELISA
    5.3 结果与分析
        5.3.1 可溶性抗体片段ELISA
        5.3.2 Sanger测序与IMGT/V-QUEST比对结果
        5.3.3 E1G抗体的交叉反应测试
    5.4 讨论与小结
第六章 结论与展望
    6.1 总结
    6.2 展望
参考文献
致谢
在学期间发表的学术论文



本文编号：3649071