人发重组角蛋白K37-3α的表达与基因改造及止血性能研究

发布时间：2022-07-02 15:02

　　随着临床与紧急事故中快速止血需求的不断增加,新型止血敷料设计与开发已成为当前的研究热点。人发角蛋白作为一种天然的生物材料,具有优异的止血、创伤修复、生物相容性和降解性,被广泛的应用于生物医学领域。针对人发角蛋白提取物成分复杂、质量及氨基酸组成难以控制等局限性,本课题组对Ι型人发角蛋白K37进行了重组表达与纯化,并首次证明了K37重组蛋白同样具备良好的止血性能。然而,人发角蛋白K37序列中有效的止血功能区域并不明确,并且由于角蛋白天然不可溶,重组角蛋白也为不溶性的包涵体。因此,研究人发角蛋白的止血功能区域以及通过基因改造提高重组角蛋白的溶解性对于新型止血蛋白材料的开发与设计具有重要意义。本课题通过截取重组角蛋白K37中序列最长、包含氨基酸信息最全面的第三个α-螺旋结构即K37-3α序列作为研究模型,并通过基因改造得到了CMK37-3α序列以增加重组角蛋白的可溶性,并利用重组蛋白异源表达技术对K37-3α及CMK37-3α两种重组蛋白进行了表达、纯化与理化表征。再采用静电纺丝技术与涂层法制备了一种新型的止血敷料—重组角蛋白/聚己内酯纤维复合膜,进而来考查K37-3α及CMK37-3α重组角... 

【文章页数】：86 页

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英汉缩略名词对照表
1 绪论
    1.1 止血材料的概述
    1.2 人发角蛋白的止血应用
    1.3 人发重组角蛋白的概述
    1.4 重组角蛋白K37 的概述
    1.5 科学问题的提出及研究意义
    1.6 课题主要内容及技术路线
2 功能区域的截取、表达纯化及表征
    2.1 引言
    2.2 材料与仪器
        2.2.1 实验材料
        2.2.2 实验仪器
    2.3 实验方法
        2.3.1 主要试剂的配制
        2.3.2 K37 角蛋白功能区域的选取
        2.3.3 K37-3α重组角蛋白的表达与纯化
        2.3.4 基因测序鉴定
        2.3.5 生物信息学分析预测
        2.3.6 蛋白标准曲线的绘制
        2.3.7 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
        2.3.8 基质辅助激光解析串联飞行时间质谱
        2.3.9 紫外全波长扫描光谱检测
        2.3.10 傅里叶变换红外光谱检测
        2.3.11 圆二色光谱检测
        2.3.12 X-射线衍射检测
        2.3.13 统计分析
    2.4 结果与讨论
        2.4.1 基因测序验证分析
        2.4.2 生物信息学分析
        2.4.3 K37-3α重组角蛋白产量分析
        2.4.4 K37-3α重组角蛋白的理化性质分析
    2.5 小结
3 功能区域的改造、表达纯化及表征
    3.1 引言
    3.2 材料与仪器
        3.2.1 实验材料
        3.2.2 实验仪器
    3.3 实验方法
        3.3.1 主要试剂的配制
        3.3.2 功能区域改造
        3.3.3 CMK37-3α重组蛋白的表达与纯化
        3.3.4 基因测序鉴定
        3.3.5 生物信息学分析预测
        3.3.6 蛋白标准曲线的绘制
        3.3.7 CMK37-3α重组蛋白的理化性质检测
        3.3.8 统计分析
    3.4 结果与讨论
        3.4.1 基因测序验证分析
        3.4.2 生物信息学分析
        3.4.3 CMK37-3α重组角蛋白的产量分析
        3.4.4 CMK37-3α重组角蛋白的理化性质分析
    3.5 小结
4 重组角蛋白/聚己内酯纤维复合膜的制备及性能研究
    4.1 引言
    4.2 实验材料与仪器
        4.2.1 实验材料
        4.2.2 实验仪器
    4.3 实验方法
        4.3.1 重组角蛋白/聚己内酯纺丝复合膜的制备
        4.3.2 扫描电镜(SEM)检测
        4.3.3 傅里叶变换红外光谱检测
        4.3.4 X-射线衍射检测
        4.3.5 力学性能检测
        4.3.6 亲水性能检测
        4.3.7 体外促凝血实验
        4.3.8 体内止血实验
        4.3.9 统计分析
    4.4 结果与讨论
        4.4.1 SEM分析
        4.4.2 FTIR-ATR分析
        4.4.3 晶型结构分析
        4.4.4 力学性能分析
        4.4.5 润湿性能分析
        4.4.6 体外促凝血实验分析
        4.4.7 体内止血实验分析
    4.5 小结
5 重组角蛋白/聚己内酯纤维复合膜的细胞相容性
    5.1 引言
    5.2 实验材料与仪器
        5.2.1 实验材料
        5.2.2 实验仪器
    5.3 实验方法
        5.3.1 细胞培养
        5.3.2 细胞的接种
        5.3.3细胞的毒性实验
        5.3.4 细胞的死活鉴定
        5.3.5 细胞的增殖检测
        5.3.6 细胞的形态观察
        5.3.7 统计学分析
    5.4 结果与讨论
        5.4.1 细胞培养状态
        5.4.2 细胞毒性分析
        5.4.3 细胞死活染色分析
        5.4.4 细胞的增殖分析
        5.4.5 细胞形态分析
    5.5 小结
6 全文总结与后续工作建议
    6.1 全文主要结论
    6.2 后续工作建议
参考文献
附录
    A.作者在攻读硕士学位期间发表的论文
    B.作者在攻读硕士学位期间参与的科研项目
    C.学位论文数据集:
致谢



本文编号：3654577