84K杨Pag4CL3/4CL5基因的遗传转化及功能研究

发布时间：2022-07-20 14:27

　　木质素是木材的重要组成成分,主要起机械支持、水分运输及防御病虫害等作用。4CL酶是控制木质素合成途径中的关键酶之一。本研究以84杨(Populus alba×P.glandul × P为实验材料,利用PCR技术从84K杨cDNA中克隆得到Pag4CL3/4CL5基因 cDNA 序列,GenBank 登录号分别为 MK183033（Pag4CL3）MK183034（Pag4CL5）。利用生物信息学软件,对Pag4CL3/4CL5基因的功能和特征进行分析。构建过表达与抑制植物表达载体,通过农杆菌介导法对84K杨进行遗传转化,获得了Pag4CL3和Pag4CL5过表达转基因株系以及共同抑制表达转基因株系。主要研究结果如下:（1）通过PCR克隆技术,以毛果杨4CL3和4CL5编码序列为参考,确定Pag4CL3编码区全长1623bp,Pag4CL5编码区全长1632bp,并对它们进行了生物信息学分析发现Pag4CL3/4CL5蛋白与毛果杨中4CL3和4CL5蛋白相似度高达97%;此外,均含有SSGTTGLPKGV和GEICIRG两个保守基序;亚细胞定位预测显示Pag4CL3/4CL5蛋白主要定位... 

【文章页数】：63 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
1 绪论
    1.1 课题研究背景
    1.2 苯丙烷类代谢途径
        1.2.1 苯丙氨酸脱氨酶
        1.2.2 肉桂酸-4羟化酶
        1.2.3 4-香豆酰-CoA连接酶
    1.3 木质素的生物合成
        1.3.1 木质素合成特异途径
        1.3.2 木质素单体的聚合
        1.3.3 4CL发现及基因功能
        1.3.4 反义4CL基因
    1.4 转基因杨树研究进展
    1.5 研究的目的及意义
    1.6 技术路线
2 Pag4CL3/4CL5基因克隆及生物信息学分析
    2.1 实验材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 主要试剂
    2.2 实验方法
        2.2.1 Pag4CL3/4CL5基因克隆
        2.2.2 Pag4CL3/4CL5基因的生物信息学分析
        2.2.3 Pag4CL3/4CL5基因在84K杨不同组织中的表达模式分析
    2.3 结果分析
        2.3.1 Pag4CL3/4CL5基因全长克隆及其编码的氨基酸序列分析
        2.3.2 84K杨4CL蛋白结构域及二、三级结构分析
        2.3.3 4CL基因系统发育树的构建
        2.3.4 84K杨Pag4CL3/4CL5功能预测
        2.3.5 Pag4CL3/4CL5基因组织表达特异性分析
    2.4 本章小结
3 Pag4CL3/4CL5植物表达载体构建及84K杨遗传转化
    3.1 实验材料
        3.1.1 植物材料
        3.1.2 菌株及载体
        3.1.3 主要试剂
    3.2 实验方法
        3.2.1 构建植物表达载体pROKⅡ-4CL3/4CL5
        3.2.2 pROKHⅡ-4CL3/4CL5在84K杨中的遗传转化
        3.2.3 pROKⅡ-4CL3/4CL5转基因抗性84K杨植株的分子检测
    3.3 结果与分析
        3.3.1 构建植物表达载体pROKⅡ-4CL3/4CL5
        3.3.2 pROKⅡ-4CL3/4CL5转基因84K杨获得
        3.3.3 pROKⅡ-4CL3/4CL5转基因84K杨鉴定
    3.4 本章小结
4 Pag4CL3/4CL5抑制表达载体构建及84K杨遗传转化
    4.1 试验材料
        4.1.1 植物材料
        4.1.2 菌种和载体
        4.1.3 主要试剂
    4.2 实验方法
        4.2.1 84K杨pRNAi-4CL3/4CL5基因抑制表达载体构建
        4.2.2 pRNAi-4CL3/4CL5在84K杨中的遗传转化
    4.3 结果与分析
        4.3.1 构建植株抑制表达载体pRNAi-4CL3/4CL5
        4.3.2 pRNAi-4CL3/4CL5转基因84K杨获得及鉴定
    4.4 本章小结
5 Pag4CL3/4CL5转基因植株的半纤维素、纤维素及木质素的检测与分析
    5.1 实验材料
        5.1.1 植物材料
        5.1.2 主要试剂
    5.2 实验方法
        5.2.1 转基因84K杨苗木的种植与取材
        5.2.2 转基因84K杨纤维素的含量检测
        5.2.3 转基因84K杨半纤维素的含量检测
        5.2.4 转基因84K杨木质素的含量检测
        5.2.5 数据统计分析
    5.3 结果与分析
        5.3.1 Pag4CL3转基因84K杨的纤维素、半纤维素和木质素含量检测
        5.3.2 Pag4CL5过表达转基因84K杨的纤维素、半纤维素和木质素检测
        5.3.3 Pag4CL3/4CL5抑制表达转基因84K杨的纤维素、半纤维素和木质素检测
    5.4 本章小结
结论
参考文献
攻读学位期间发表的学术论文
致谢
附件


【参考文献】：
期刊论文
[1]84K杨引种栽培及扦插育苗研究[J]. 李慧,赵慧,闵现东,李启峰,牛天印.  现代农业科技. 2017(13)
[2]毛白杨4-香豆酸:辅酶A连接酶（4CL3）的酶学特征研究[J]. 饶国栋,张永卓,魏弘宜,蒋湘宁,陆海,张建国.  林业科学研究. 2013(05)
[3]羽衣甘蓝中一个突变型肉桂酸-4-羟化酶基因的克隆及分析[J]. 陈安和,李加纳,柴友荣,王瑞,吕俊.  园艺学报. 2007(04)
[4]抑制4CL基因表达获得低木质素含量的转基因毛白杨[J]. 贾彩红,赵华燕,王宏芝,邢智峰,杜克久,宋艳茹,魏建华.  科学通报. 2004(07)
[5]光照及机械损伤对银杏叶苯丙氨酸解氨酶活性的影响[J]. 刘卫红,程水源.  湖北农业科学. 2003(03)
[6]杨树造纸的开发利用与可持续发展的途径[J]. 袁传武.  湖北林业科技. 1998(04)



本文编号：3664164