Kdm2b基因敲入双loxp序列的NIH3T3细胞株的构建

发布时间：2022-07-27 13:22

　　目的利用CRISPR/Cas9技术与同源重组技术在组蛋白去甲基化酶Kdm2b基因的特定位置敲入双loxp序列,为后期制备条件性敲除鼠及基因功能研究提供基础。方法利用CRISPR/Cas9靶向性原理,根据Kdm2b基因第7个外显子的5臂端和第9个外显子的3臂端设计两个sgRNA,构建sgRNA-PX459重组质粒。从Kdm2b基因上克隆出同源臂,将同源臂插入带有loxp序列的Vector 5中,利用引物从Vector 5质粒克隆得到loxp-同源臂序列的双链Donor DNA。通过脂质体转染将sgRNA-PX459重组质粒和双链Donor DNA导入小鼠NIH3T3细胞,利用嘌呤霉素筛选细胞,挑选阳性单克隆。提取NIH3T3细胞基因组进行PCR,对PCR产物酶切鉴定,同时对Kdm2b基因进行测序。结果电泳和测序结果显示sgRNA-PX459重组质粒构建成功,双链Donor DNA测序结果与设计相符合,成功在NIH3T3细胞Kdm2b基因上第7个外显子的5臂端和第9个外显子的3臂端各敲入一个loxp序列。结论获得Kdm2b基因敲入双loxp序列的NIH3T3细胞株。 

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【文章目录】：
1 材料与方法
    1.1 主要实验材料
    1.2 定点切割双链基因组DNA的sgRNA表达载体的构建
    1.3 带有loxp序列的双链Donor DNA的设计与构建
    1.4 特定切割位点loxp序列敲入
        1.4.1 sgRNA5切割位点的loxp序列敲入
        1.4.2 sgRNA3切割位点的loxp序列敲入
2 结果
3 讨论



本文编号：3665531