大叶落地生根干旱胁迫响应基因kdnovel1007的克隆与表达特性分析

发布时间：2017-05-15 16:15

  本文关键词：大叶落地生根干旱胁迫响应基因kdnovel1007的克隆与表达特性分析，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：干旱胁迫严重影响着植物的正常生长与发育,从而对农业生产产生不可估量的影响,因此,对干旱及植物抗旱性的相关研究必不可少。植物在干旱胁迫下,往往采取一定的策略来积极响应干旱胁迫,从而适应不利条件以保证自身的正常生长。本研究以抗旱植物景天科伽蓝菜属大叶落地生根(Kalanchoe daigremontiana)为研究材料,选择大叶落地生根cDNA差减文库中特异表达的EST (Singlet1007)序列进行研究,该序列在GenBank中比对并没有发现同源序列。使用RACE手段对其进行全长序列克隆,获得其全长基因并对该全长序列进行生物信息学分析,获得其开放阅读框和编码蛋白质的序列信息。对该基因所编码的蛋白质序列进行生物信息学分析预测得到该蛋白质的理化性质、功能结构域、跨膜区域、亚细胞定位、信号肽预测及空间结构等信息,使我们能更好的理解该蛋白可能具有的功能。为探究该基因是否为干旱胁迫响应基因,在自然干旱情况下,对该基因的表达情况进行实时荧光定量分析研究,从而对该基因在自然干旱情况下的表达特征进行分析。运用RACE手段克隆该基因全长和生物信息学分析得出kdnovel1007基因全长1022bp,其中开放阅读框位于该基因131-598 bp之间,共468bp,编码155个氨基酸。对其编码的蛋白质进行生物信息学分析预测得出,该蛋白的分子式为C733H1194 N216O234S8,原子总量2385,分子质量约为1.7k Da,理论等电点pI为8.35,不稳定指数为63.12,说明该蛋白质不稳定。进行疏水性／亲水性预测,得出该蛋白质的跨膜区主要为疏水性氨基酸,非跨膜区主要为亲水性氨基酸。通过信息学对其亚细胞表达位置进行预测,发现其可能位于植物细胞的叶绿体内。通过保守结构域预测,发现该基因编码蛋白序列在21-89位与GrpE super family有相似保守结构域。通过跨膜结构域预测,发现该蛋白可能为跨膜蛋白,蛋白序列的C端可能具有一个跨膜区。对该蛋白质的二级结构进行预测,发现其可能具有无规则卷曲结构、α-螺旋和延伸链结构,三级结构预测还发现其可能具有p-折叠结构,但无p-转角结构。进行信号肽预测,发现该蛋白不含信号肽,可能不是分泌蛋白。在自然干旱下对大叶落地生根叶片中kdnovel1007基因进行实时荧光定量检测,发现该基因的表达量在土壤相对含水量为10%-40%的范围内,随土壤相对含水量的下降而上升。土壤相对含水量为40%时,该基因表达量为对照组的5.73倍,土壤含水量为30%时该基因表达量为对照组的5.93倍,土壤含水量为20%时该基因的表达量达到最高值,是对照组的13.43倍,土壤含水量为10%时该基因与上一个干旱程度相比表达量下降迅速,但其表达量仍为对照组的2.51倍。干旱胁迫可以诱导该基因的上调表达,说明kdnovel1007基因是干旱胁迫响应基因,可能在植物对抗干旱胁迫中扮演着重要的角色。
【关键词】：干旱胁迫 大叶落地生根 kdnovel1007基因 生物信息学 实时定量PCR
【学位授予单位】：北京林业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q943.2;Q945.78
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-7
• 缩略词7-10
• 1 引言10-27
• 1.1 干旱对植物生长影响研究进展10-18
• 1.1.1 植物对干旱的响应机制10-15
• 1.1.2 干旱对光合作用的影响15-16
• 1.1.3 干旱对呼吸作用的影响16-18
• 1.2 抗旱相关基因研究进展18-24
• 1.2.1 功能基因18-21
• 1.2.2 调节基因21-24
• 1.3 大叶落地生根简介24-25
• 1.4 研究的目的和意义25-26
• 1.5 技术路线26-27
• 2 大叶落地生根kdnovel1007基因的克隆27-45
• 2.1 落地生根总RNA的提取27-30
• 2.1.1 材料与仪器27
• 2.1.2 试验方法27-29
• 2.1.3 结果与分析29
• 2.1.4 讨论29-30
• 2.2 落地生根kdnovel1007基因全长序列的克隆30-44
• 2.2.1 试剂与仪器30
• 2.2.2 试验方法30-38
• 2.2.3 结果与分析38-40
• 2.2.4 讨论40-44
• 2.3 小结44-45
• 3 kdnovel1007基因编码蛋白质生物信息学分析45-52
• 3.1 分析方法45-46
• 3.2 分析结果46-49
• 3.3 讨论49-51
• 3.4 小结51-52
• 4 kdnovel1007基因的实时定量PCR分析52-62
• 4.1 材料与试剂52-53
• 4.1.1 试验材料52
• 4.1.2 试验试剂52-53
• 4.2 试验方法53-55
• 4.2.1 引物设计合成53
• 4.2.2 RNA提取53
• 4.2.3 逆转录53-54
• 4.2.4 real-time PCR54
• 4.2.5 数据分析54-55
• 4.3 结果与分析55-59
• 4.3.1 kdnovel1007基因PCR扩增特异性55-57
• 4.3.2 kdnovel1007基因相对表达量检测57-59
• 4.4 讨论59-61
• 4.4.1 实时荧光定量PCR59
• 4.4.2 扩增特异性59
• 4.4.3 kdnovel 1007基因相对表达量59-61
• 4.5 小结61-62
• 5 结论与展望62-65
• 5.1 结论62-64
• 5.1.1 大叶落地生根kdnovel1007基因的克隆与生物信息学分析62-63
• 5.1.2 干旱条件下kdnovel1007基因的表达分析63-64
• 5.2 展望64-65
• 参考文献65-75
• 个人简介75-76
• 导师简介76-77
• 致谢77

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