菲律宾蛤仔凝集素VpClec-1和VpClec-2基因克

发布时间：2022-10-05 18:57

　　我国贝类养殖产业迅速发展的同时,出现了一系列病原体入侵引起的健康问题,严重制约着海洋生态的可持续发展。挖掘贝类响应病原菌胁迫的关键因子,可为贝类的免疫防御机制研究提供可靠的数据支撑,同时对养殖过程中的疾病控制和健康管理具有十分重要的理论意义。本论文在菲律宾蛤仔中克隆出两种免疫相关分子——C型凝集素（VpClec-1、VpClec-2）,对其序列进行分析;利用实时荧光定量PCR技术（qRT-PCR）,对两种C型凝集素在菲律宾蛤仔中的组织分布特性进行研究;构建相应的重组蛋白,并对其免疫活性进行具体探究,得到研究结果如下:（1）基因序列分析结果显示,菲律宾蛤仔VpClec-1基因cDNA序列的全长为588 bp,开放阅读框（ORF）为489 bp,编码162个氨基酸,等电点为pI=4.26,蛋白预测分子量为15.98 kDa;VpClec-2基因cDNA序列的全长为688 bp,ORF为555 bp,编码184个氨基酸,等电点为p I=8.40,蛋白预测分子量为18.74 kDa。对VpClec-1和VpClec-2基因的氨基酸序列进行同源性分析、多序列比对,发现两种基因均与C型凝集素序列和... 

【文章页数】：76 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
致谢
摘要
Abstract
第1章 引言
    1.1 无脊椎动物的固有免疫
    1.2 凝集素研究进展
        1.2.1 凝集素简介
        1.2.2 动物凝集素的分类
            1.2.2.1 C型凝集素
            1.2.2.2 S型凝集素(半乳糖凝集素)
            1.2.2.3 Pentraxins
            1.2.2.4 P型凝集素
            1.2.2.5 L型凝集素
    1.3 弧菌对海水养殖造成严重危害
    1.4 本研究目的和意义
    1.5 本研究技术路线图
第2章 菲律宾蛤仔VpClec-1和VpClec-2 基因克隆和序列分析
    2.1 实验材料
        2.1.1 实验动物准备
        2.1.2 实验所用主要引物信息
        2.1.3 实验所用主要试剂
        2.1.4 实验所用主要仪器
        2.1.5 实验所用主要试剂的配制
    2.2 实验方法
        2.2.1 菲律宾蛤仔组织样品的处理
        2.2.2 菲律宾蛤仔总RNA的提取
        2.2.3 菲律宾蛤仔总cDNA的合成
        2.2.4 基因VpCle-1和VpClec-2的RACE技术扩增
        2.2.5 基因VpCle-1和VpClec-2 的生物信息学分析
    2.3 实验结果
        2.3.1 基因VpCle-1和VpClec-2的c DNA全长及序列特征
        2.3.2 基因VpCle-1和VpClec-2 的多序列比对特征
        2.3.3 基因VpCle-1和VpClec-2 的系统进化特征
    2.4 实验讨论
第3章 菲律宾蛤仔VpClec-1和VpClec-2 基因表达规律
    3.1 实验材料
        3.1.1 实验动物准备
        3.1.2 实验所用主要引物信息
        3.1.3 实验所用主要试剂
        3.1.4 实验所用主要仪器
        3.1.5 实验所用主要试剂的配制
    3.2 实验方法
        3.2.1 菲律宾蛤仔组织样品的处理
        3.2.2 菲律宾蛤仔总RNA的提取
        3.2.3 菲律宾蛤仔总cDNA的合成
        3.2.4 基因VpCle-1和VpClec-2的RACE技术扩增
        3.2.5 实时荧光定量PCR法检测基因VpCle-1和VpClec-2 的表达规律
        3.2.6 数据分析
    3.3 实验结果
        3.3.1 基因VpClec-1和VpClec-2 在菲律宾蛤仔不同组织中的表达规律
        3.3.2 基因VpClec-1和VpClec-2 在微生物刺激后的表达规律
    3.4 实验讨论
第4章 菲律宾蛤仔VpClec-1和VpClec-2 免疫活性分析
    4.1 实验材料
        4.1.1 实验样品
        4.1.2 实验仪器
        4.1.3 实验试剂
        4.1.4 实验引物
        4.1.5 实验试剂配方
    4.2 实验方法
        4.2.1 菲律宾蛤仔组织样品处理
        4.2.2 菲律宾蛤仔总RNA提取
        4.2.3 菲律宾蛤仔总cDNA合成
        4.2.4 菲律宾蛤仔RACE技术扩增
        4.2.5 目的片段的获取
        4.2.6 构建原核表达载体
        4.2.7 质粒提取
        4.2.8 重组蛋白rVpClec-1和rVpClec-2 的转化
        4.2.9 重组蛋白rVpClec-1和rVpClec-2 的转表达与检测
        4.2.10 重组蛋白rVpClec-1和rVpClec-2 的纯化
        4.2.11 重组蛋白rVpClec-1和rVpClec-2 的复性与浓度测定
        4.2.12 抗VpClec-1和VpClec-2 的多克隆抗体制备
        4.2.13 蛋白质免疫印迹(Western-Blot)
        4.2.14 rVpClec-1和rVpClec-2的PAMPs结合活性分析
        4.2.15 rVpClec-1和rVpClec-2 的凝菌活性分析
        4.2.16 rVpClec-1和rVpClec-2 的抑菌活性分析
        4.2.17 rVpClec-1和rVpClec-2 的吞噬活性分析
        4.2.18 rVpClec-1和rVpClec-2 的趋化活性分析
        4.2.19 数据分析
    4.3 实验结果
        4.3.1 VpClec-1和VpClec-2 重组蛋白的获得和多抗制备
        4.3.2 抗VpClec-1和VpClec-2的PAMPs结合、凝菌和抑菌活性
        4.3.3 rVpClec-1和rVpClec-2 的吞噬和趋化活性
    4.4 实验讨论
第5章 结论与展望
参考文献
作者简历



本文编号：3686321