斑点叉尾鮰E.ictaluri与Y.ruckeri二联基因OmpN2-OmpF亚单位和口服疫苗的制备与免疫效应研究

发布时间：2022-10-05 19:06

　　渔用疫苗作为替代抗生素和化学药物进行鱼类细菌性疾病防治更为安全有效的防治方法,得到了世界各国的广泛重视。多联疫苗因其可预防多种疾病、减少接种次数、简化免疫程序等特点,已成为当今世界疫苗的研究和发展方向。鮰爱德华菌（Edwardsiella ictaluri）和鲁氏耶尔森菌（Yersinia ruckeri）作为近年来斑点叉尾鮰养殖频发的两种细菌性疾病病原,给我国斑点叉尾鮰乃至整个水产养殖业的健康发展造成了严重危害。本研究以斑点叉尾鮰源E.ictaluri外膜蛋白OmpN2和Y.rucker外膜蛋白OmpF为研究对象,在对其进行分子克隆、生物信息学分析、原核表达和免疫原性分析基础上初步研究其作为疫苗候选目的抗原的潜力。通过添加多肽Linker接头序列、酶切连接、融合基因技术等分子生物学手段构建二联融合基因N2-F,通过分子克隆和原核表达制备二联基因N2-F亚单位疫苗。此外,采用海藻酸钠-壳聚糖等天然高分子复合物作为包被材料,研制二联基因N2-F口服微球疫苗,分别以腹腔注射和拌饲口服方式将二联基因N2-F亚单位疫苗和口服疫苗免疫接种斑点叉尾鮰,通过特异性抗体水平、非特异性免疫指标、免疫相关... 

【文章页数】：192 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
Abstract
符号说明
第一章 文献综述
    1 斑点叉尾鮰养殖概况
    2 鮰爱德华氏菌研究进展
        2.1 生物学特性
        2.2 宿主种类和范围
        2.3 相关毒力因子研究
        2.5 鮰爱德华氏菌外膜蛋白的研究
        2.6 鮰爱德华氏菌的疫苗研究
    3 鲁氏耶尔森氏菌研究进展
        3.1 生物学特性
        3.2 宿主种类和范围
        3.3 相关毒力因子研究
        3.4 鲁氏耶尔森氏菌外膜蛋白研究
        3.5 鲁氏耶尔森氏菌疫苗研究
    4 渔用疫苗研究进展
        4.1 渔用疫苗的发展历程
        4.2 渔用疫苗的种类
        4.3 渔用疫苗的免疫方式
    5 渔用口服疫苗载体研究
        5.1 微囊和微球载体
        5.2 减毒细菌载体
        5.3 生物被膜载体
        5.4 生物载体疫苗
    6 本研究的目的和意义
第二章 鮰爱德华氏菌OmpN2 与鲁氏耶尔森氏菌OmpF基因的分子克隆与生物信息学分析
    1 试验材料
        1.1 菌株和质粒
        1.2 主要试剂
        1.3 主要仪器
    2 试验方法
        2.1 引物设计与合成
        2.2 菌株培养、DNA提取与PCR扩增
        2.3 重组克隆质粒的构建
        2.4 重组克隆质粒的鉴定
        2.5 核苷酸序列特征分析
        2.6 氨基酸序列特征分析
    3 结果
        3.1 目的基因的扩增和T克隆鉴定
        3.2 核苷酸序列特征分析
        3.3 氨基酸序列特征分析
        3.4 OmpN2和OmpF核苷酸和氨基酸序列相似性比对
    4 讨论
    5 小结
第三章 OmpN2与OmpF的原核表达与免疫原性分析
    1 试验材料
        1.1 试验动物
        1.2 菌株和质粒
        1.3 主要试剂
        1.4 主要仪器
    2 试验方法
        2.1 引物设计与合成
        2.2 菌株培养、DNA提取与PCR扩增
        2.3 重组克隆质粒的构建
        2.4 重组克隆质粒的鉴定
        2.5 重组表达质粒的构建
        2.6 重组表达质粒的鉴定
        2.7 重组蛋白的诱导表达
        2.8 重组蛋白的大量制备及纯化
        2.9 兔抗重组蛋白rtOmpN2和rtOmpF多克隆抗体的制备与纯化
        2.10 Western blotting分析
        2.11 目的蛋白在细菌表面分布验证
    3 结果
        3.1 重组表达质粒的构建与鉴定
        3.2 重组蛋白rtOmpN2和rtOmpF的表达及纯化
        3.3 重组蛋白的免疫原性分析
        3.4 目的蛋白在细菌表面的分布
    4 讨论
    5 小结
第四章 二联融合基因N2-F的构建,分子克隆,原核表达与免疫原性分析
    1 试验材料
        1.1 试验动物
        1.2 菌株和质粒
        1.3 主要试剂
        1.4 主要仪器
    2 试验方法
        2.1 Linker序列选择与引物设计
        2.2 重组克隆质粒T-N2-linker和 T-linker-F的构建与鉴定
        2.3 重组表达质粒P-N2-linker的构建与鉴定
        2.4 重组表达质粒P-N2-linker-F的构建与鉴定
        2.5 融合蛋白N2-F的诱导表达及纯化
        2.6 兔抗融合蛋白N2-F多克隆抗体的制备与纯化
        2.7 融合蛋白N2-F免疫原性检测
    3 结果
        3.1 N2-linker与 linker-F的 PCR扩增
        3.2 重组克隆质粒T-N2-linker和 T-linlker-F的构建与鉴定
        3.3 重组表达质粒P-N2-linker的构建与鉴定
        3.4 重组表达质粒P-N2-Linker-F的构建与鉴定
        3.5 融合蛋白N2-F的诱导表达及纯化
        3.6 融合蛋白N2-F的免疫原性分析
    4 讨论
    5 小结
第五章 二联基因N2-F亚单位疫苗对斑点叉尾鮰免疫效果分析
    1 试验材料
        1.1 试验动物
        1.2 疫苗、菌株与质粒
        1.3 主要试剂
        1.4 主要仪器
    2 试验方法
        2.1 细菌复壮
        2.2 亚单位疫苗制备
        2.3 免疫程序
        2.4 收集血清
        2.5 血清免疫相关指标检测
        2.6 攻毒试验及相对保护率检测
        2.7 免疫相关基因表达分析
        2.8 数据统计分析
    3 结果
        3.1 血清抗体水平检测
        3.2 血清溶菌酶活性检测
        3.3 血清补体C3 活性检测
        3.4 血清总蛋白含量检测
        3.5 血清SOD活性检测
        3.6 免疫相关基因表达分析
        3.7 攻毒试验及相对保护率检测
    4 讨论
    5 小结
第六章 二联基因口服微球疫苗的制备、条件优化及理化特性分析
    1 试验材料
        1.1 试验动物
        1.2 蛋白与主要试剂
        1.3 主要仪器
    2 试验方法
        2.1 海藻酸钠-壳聚糖复合微球制备流程
        2.2 包封率和载药率测定
        2.3 单因素试验
        2.4 响应面试验
        2.5 口服微球疫苗的理化特性分析
        2.6 口服微球疫苗的抗原性检测
        2.7 口服微球疫苗的安全性检测
    3 结果
        3.1 单因素试验
        3.2 响应面试验结果
        3.3 响应面分析及结果验证
        3.4 口服微球疫苗的理化特性分析
        3.5 口服微球疫苗的抗原性检测
        3.6 口服微球疫苗的安全性检测
    4 讨论
    5 小结
第七章 二联基因口服疫苗对斑点叉尾鮰的免疫效果分析
    1 试验材料
        1.1 试验动物
        1.2 疫苗、菌株与质粒
        1.3 主要试剂
        1.4 主要仪器
    2 试验方法
        2.1 口服微球疫苗制备
        2.2 口服疫苗饲料制备
        2.3 免疫程序
        2.4 血清和肠粘液采集
        2.5 肠黏液免疫相关指标检测
        2.6 血清免疫相关指标检测
        2.7 攻毒试验及相对保护率检测
        2.8 免疫相关基因表达分析
        2.9 数据统计分析
    3 结果
        3.1 肠黏液免疫指标
        3.2 血清免疫相关指标
        3.3 免疫相关基因表达分析
        3.4 攻毒试验及相对保护率检测
    4 讨论
    5 小结
全文总结
论文创新点
参考文献
致谢
作者简历


【参考文献】：
期刊论文
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硕士论文
[1]斑点叉尾鮰源海豚链球菌Srr蛋白海藻酸钠—壳聚糖口服疫苗的制备及免疫效果评价[D]. 王兴丽.四川农业大学 2017
[2]鮰爱德华氏菌和鲁氏耶尔森氏菌二联口服疫苗制备及免疫效果评价[D]. 阳磊.四川农业大学 2015
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[8]罗非鱼无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）LrrG蛋白的原核表达及其免疫原性研究[D]. 陈雪.上海海洋大学 2014
[9]小鼠局灶性脑缺血再灌注模型建立及二氢杨梅素干预研究[D]. 陈永畅.广西医科大学 2014
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本文编号：3686334