神经生长因子通过PTEN基因抑制肝癌细胞增殖的机制

发布时间：2022-10-08 21:25

　　本论文通过Sanger测序方法检验肝癌细胞系HepG2和HuH7中PTEN基因突变情况。结果显示,HepG2细胞中包含野生型PTEN基因序列,HuH7细胞中检测到PTEN基因发生突变,因此选择肝癌细胞系HepG2用于后续实验。利用Western Blotting检测肝癌细胞HepG2中PTEN蛋白和肝癌肿瘤标志物甲胎蛋白AFP的表达水平,结果显示两者的蛋白表达量呈负相关性。NGF是最早开始研究也是研究最清楚的神经营养因子,近年来实验研究表明,NGF参与到肿瘤生长、分化、血管形成以及转移的过程中,在肿瘤的发生与发展中发挥重要的作用。为了进一步探索NGF在肝癌细胞中的机制机理,本研究利用NGF处理野生型肝癌细胞HepG2和PTEN基因敲除的HepG2细胞,检测细胞增殖、凋亡以及周期变化。结果显示,NGF能够有效抑制野生型HepG2细胞的增殖,促进其凋亡并同时诱导细胞内G0/G1周期阻滞,对于PTEN基因敲除的HepG2细胞,NGF对其增殖、凋亡和周期没有显著性作用。为了进一步探索肝癌细胞中PTEN蛋白和AFP蛋白的负相关作用,使用EGF、ATRA和NGF分别处理HepG2细胞,qRT-PC... 

【文章页数】：84 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
abstract
1 绪论
    1.1 引言
    1.2 肝癌
        1.2.1 肝癌致病因素
            1.2.1.1 肝炎病毒与肝癌
            1.2.1.2 代谢与肝癌
        1.2.2 肝癌信号通路
            1.2.2.1 YAP
            1.2.2.2 PI3K/Akt/mT0R
            1.2.2.3 ANXA3/JNK
            1.2.2.4 NANOG
        1.2.3 HCC诊断中的肝癌标志物
            1.2.3.1 甲胎蛋白异质体3
            1.2.3.2 鳞状细胞癌抗原
            1.2.3.3 脱-γ-羧基凝血酶原
            1.2.3.4 磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3
            1.2.3.5 高尔基体糖蛋白73
            1.2.3.6 血管内皮生长因子
        1.2.4 HCC肝癌治疗相关靶点
            1.2.4.1 抗体疗法
            1.2.4.2 遗传学治疗
            1.2.4.3 HCSC小生态环境靶向治疗
            1.2.4.4 分子靶向治疗
        1.2.5 肝癌治疗
            1.2.5.1 肝切除术
            1.2.5.2 肝移植
            1.2.5.3 介入治疗
            1.2.5.4 消融治疗
            1.2.5.5 放射治疗
            1.2.5.6 系统化疗
            1.2.5.7 靶向治疗
            1.2.5.8 免疫治疗和基因治疗
            1.2.5.9 中医治疗
    1.3 抑癌基因PTEN基因及PI3K/Akt信号通路
        1.3.1 抑癌基因PTEN基因
        1.3.2 PI3K/Akt信号通路
    1.4 CRISPR/Cas基因编辑
        1.4.1 ZFNs技术
        1.4.2 TALENs技术
        1.4.3 CRISPR/Cas技术
    1.5 本研究的主要内容和意义
        1.5.1 研究主要内容
        1.5.2 研究意义
        1.5.3 设计路线
2 NGF抑制HepG2细胞增殖促进其凋亡
    2.1 前言
    2.2 实验材料
        2.2.1 实验细胞系
        2.2.2 实验试剂
        2.2.3 实验溶液
    2.3 实验设备
    2.4 实验设计
        2.4.1 细胞培养
        2.4.2 细胞传代
        2.4.3 WST-1细胞增殖检测
            2.4.3.1 WST-1细胞增殖检测原理
            2.4.3.2 WST-1细胞增殖检测实验步骤
        2.4.4 Annexin V-FITC细胞凋亡检测
            2.4.4.1 Annexin V-FITC细胞凋亡检测原理
            2.4.4.2 Annexin V-FITC细胞凋亡检测实验步骤
        2.4.5 细胞周期检测实验步骤
        2.4.6 CRISPR/Cas9基因编辑敲除PTEN基因
    2.5 实验结果
        2.5.1 细胞增殖
        2.5.2 细胞凋亡
        2.5.3 细胞周期
    2.6 小结
3 Cas9蛋白的表达与纯化
    3.1 引言
    3.2 实验材料
        3.2.1 菌种及质粒
        3.2.2 实验试剂
        3.2.3 实验溶液
    3.3 实验仪器
    3.4 实验设计
        3.4.1 大肠杆菌BL-21(DE3)感受态的制备
        3.4.2 质粒转化宿主菌株
        3.4.3 Cas9蛋白诱导表达
        3.4.4 表达产物蛋白分析
        3.4.5 诱导表达条件优化
        3.4.6 过表达蛋白
        3.4.7 镍柱亲和纯化
        3.4.8 透析
        3.4.9 超滤浓缩
    3.5 实验结果
    3.6 小结
4 肝癌细胞HepG2中PTEN基因作用以及信号通路
    4.1 引言
    4.2 实验材料
        4.2.1 实验细胞系
        4.2.2 实验试剂
        4.2.3 主要溶液
    4.3 实验设备
    4.4 实验设计
        4.4.1 Western Blotting检测蛋白表达水平
        4.4.2 RNA提取
        4.4.3 快速反转录合成第一链cDNA
        4.4.4 SYBR Green荧光定量预混试剂qRT-PCR
    4.5 实验结果
        4.5.1 肝癌细胞序列比对
        4.5.2 EGF处理HepG2细胞
        4.5.3 全反式维甲酸ATRA处理细胞
        4.5.4 NGF处理HepG2细胞
        4.5.5 Akt抑制剂处理细胞
        4.5.6 CRISPR/Cas9敲除PTEN基因
        4.5.7 细胞通路
    4.6 小结
5 结论与展望
    5.1 结论
    5.2 展望
参考文献
附录
致谢
作者和导师简介
附件


【参考文献】：
期刊论文
[1]原发性肝癌全球流行情况和危险因素的新进展[J]. 朱笑生,刘文超.  现代肿瘤医学. 2018(14)
[2]酸性环境诱导肝癌HepG2细胞EMT[J]. 周春芳,赵珊珊,孙泽群,吴军,查火龙,袁雅红.  实用肿瘤学杂志. 2017(03)
[3]Hepatitis B virus,HBx mutants and their role in hepatocellular carcinoma[J]. Ashraf Ali,Hany Abdel-Hafiz,Mohd Suhail,Amany Al-Mars,Mohammad Khalid Zakaria,Kaneez Fatima,Sultan Ahmad,Esam Azhar,Adeel Chaudhary,Ishtiaq Qadri.  World Journal of Gastroenterology. 2014(30)
[4]神经生长因子及其受体与肿瘤相关性研究进展[J]. 何学元,张有成.  国际消化病杂志. 2010(04)



本文编号：3688457