极小单胞菌Pusillimonas sp.T2分解代谢烟酸的关键基因功能研究

发布时间：2022-10-30 12:49

　　吡啶及其衍生物在自然界中普遍存在,6-羟基烟酸（6HNA）作为吡啶衍生物中重要的化工中间体,化学合成困难,而微生物转化的方法因其温和、流程简单和产品纯度高等优点具有广阔的应用前景。本研究以尼古丁降解菌Pusillimonas sp.T2为对象,研究了其降解烟酸（NA）的特性、代谢途径及分子降解机制。通过基因组测序和生物信息比较相结合的方法克隆到一个新的三组分编码烟酸羟化酶的基因,为绿色转化6HNA的生产提供了理论方法和依据。研究内容主要包括以下三个方面:（1）研究了菌株T2对NA的降解特性,并对其代谢途径进行了推测。结果显示:菌株T2对NA的最适降解条件为30℃和pH7.0;当接种量OD600为0.60时,可以在3.5个小时内将浓度为300 mg/L的NA完全降解;推测其降解途径为 NA→6HNA→2,5-DHP→→TCA 循环。（2）通过对菌株T2进行全基因组测序,获得了基因组序列的精细图谱（52个Scaffolds）。菌株T2的基因组大小为3.3 Mb,GC含量为56.9%。生物信息学表明,该菌株基因组编码3054个开放阅读框。利用RAST、nr、Swiss-Prot、COG、KE... 

【文章页数】：101 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
致谢
摘要
ABSTRACT
符号与缩略语说明
第一章 绪论
    1.1 烟碱类杀虫剂
        1.1.1 烟碱类杀虫剂的发展
        1.1.2 烟碱类杀虫剂中间体的研究
    1.2 烟酸和6-羟基烟酸的简介
        1.2.1 烟酸和6-羟基烟酸的基本性质
        1.2.2 烟酸和6-羟基烟酸的用途
    1.3 烟酸的微生物降解的研究进展
        1.3.1 降解烟酸的微生物种类
        1.3.2 烟酸的微生物代谢途径及酶学研究
    1.4 本论文研究目的、意义和主要内容
        1.4.1 研究目的和意义
        1.4.2 研究的主要内容
第二章 烟酸降解菌的生长及降解特性研究
    2.1 实验材料
        2.1.1 菌株、试剂及仪器
        2.1.2 培养基
        2.1.3 缓冲液
    2.2 实验方法
        2.2.1 菌株T2对烟酸降解能力的初步验证
        2.2.2 菌株T2种子液的制备
        2.2.3 菌株T2的生物量及烟酸残留量和中间代谢产物的检测方法
        2.2.4 外界条件对菌株T2降解特性的影响
        2.2.5 菌株T2生长与烟酸降解关系的探究
    2.3 实验结果与分析
        2.3.1 菌株T2对烟酸的降解能力
        2.3.2 pH值对菌株T2降解烟酸的影响
        2.3.3 温度对菌株T2降解烟酸的影响
        2.3.4 接种量对菌株T2降解烟酸的影响
        2.3.5 烟酸初始浓度对菌株T2降解烟酸的影响
        2.3.6 菌株T2对烟酸的利用
        2.3.7 菌株T2降解代谢产物的鉴定
    2.4 本章小结
第三章 Pusillimonas sp. T2基因组测序、功能注释分析及基因比较
    3.1 实验材料与方法
        3.1.1 菌株,试剂与培养基
        3.1.2 基因组DNA提取
        3.1.3 全基因组序列上机文库的构建
        3.1.4 生物学信息分析
        3.1.5 烟酸降解关键基因的查找和生物信息学分析
    3.2 结果与分析
        3.2.1 菌株T2基因组DNA提取
        3.2.2 测序数据统计
        3.2.3 基因组序列的组装
        3.2.4 预测基因结果
        3.2.5 rRNA/tRNA预测结果
        3.2.6 基因功能注释结果
        3.2.7 烟酸代谢相关基因分析
    3.3 本章小结
第四章 烟酸降解关键基因nahAB_1B_2的克隆与功能鉴定
    4.1 实验材料
        4.1.1 菌株及实验仪器
        4.1.2 培养基及培养条件
        4.1.3 主要试剂及缓冲液
        4.1.4 引物设计
    4.2 实验方法
        4.2.1 菌株T2基因组DNA提取
        4.2.2 菌株T2基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳检测
        4.2.3 质粒DNA的小量提取
        4.2.4 Over-lap PCR构建同源重组片段
        4.2.5 大肠杆菌感受态细胞的制备
        4.2.6 表达载体的构建
    4.3 实验结果与分析
        4.3.1 菌株T2基因组DNA提取
        4.3.2 nahA、nahAB_1和nahB_2的特异性扩增
        4.3.3 载体pBBR-MCS2酶切
        4.3.4 重组菌株的烟酸降解功能验证
    4.4 本章小结
第五章 酶学特性研究
    5.1 实验材料
        5.1.1 菌株、质粒及实验仪器
        5.1.2 培养基及培养条件
        5.1.3 主要试剂及缓冲液
    5.2 实验方法
        5.2.1 表达菌株的诱导与表达
        5.2.2 蛋白的功能鉴定
    5.3 菌株HZN7-pBBR-nahAB_1B_2粗酶液特性研究
        5.3.1 粗酶液中蛋白含量测定
        5.3.2 NahAB_1B_2的动力学参数
        5.3.3 金属离子对酶活力的影响
        5.3.4 O_2消耗检测
        5.3.5 NahAB_1B_2底物特异性检测
    5.4 实验结果与分析
        5.4.1 NahAB_1B_2的活性
        5.4.2 酶含量和酶动力学参数
        5.4.3 金属离子对NahAB_1B_2酶活的影响
        5.4.4 NahAB_1B_2催化反应中O_2的来源
        5.4.5 NahAB_1B_2的底物特异性
    5.5 本章小结
第六章 总结与展望
    6.1 研究内容及结论
    6.2 创新点
    6.3 不足与展望
参考文献
附录1: 仪器设备
附录2: 文中所用培养基及试剂配方
附录3: 缓冲液
附录4: 相关DNA序列
作者简介
    1 作者简历
    2 攻读硕士学位期间发表的学术论文
    3 参与的科研项目
学位论文数据集


【参考文献】：
期刊论文
[1]浅析烟碱类杀虫剂及其市场走势[J]. 刘智.  农药市场信息. 2017 (22)
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[3]蛋白质含量测定方法的规范化研究[J]. 邵泓,吕晶,陈钢.  中国药品标准. 2011(02)
[4]3种方法测定大鼠肝微粒体蛋白含量的比较[J]. 简暾昱,徐帆,廖春龙,徐贵丽.  中国药师. 2011(03)
[5]取代剧毒农药的新一代烟碱类杀虫剂[J]. 程志明.  上海化工. 2007(09)
[6]睾酮丛毛单胞菌JA1菌株羟基化烟酸产生6-羟基烟酸的发酵产酶条件研究[J]. 杨瑶,袁生,戴亦军.  工业微生物. 2007(04)
[7]农药对我国农产品污染的现状及控制对策[J]. 张青,周国强.  洛阳大学学报. 2007(02)
[8]烟酸用于一氯均三嗪型活性染料中性浴上染真丝绸的研究[J]. 董玮,谢维斌,何瑾馨.  纺织科技进展. 2007(01)
[9]新型烟碱类杀虫剂啶虫脒研究进展[J]. 周育,庾琴,侯慧锋,乔雄梧,李顺鹏.  植物保护. 2006(03)
[10]烟酸的研究进展[J]. 李艳云,尹振晏,宫彩红.  北京石油化工学院学报. 2006(01)

博士论文
[1]吡啶衍生物的微生物羟基化及其酶的基因克隆与表达的研究[D]. 杨瑶.南京师范大学 2008

硕士论文
[1]尼古丁降解菌Pusillimonas sp.T2的筛选、鉴定、降解特性及代谢途径的初步研究[D]. 温荣提.浙江工业大学 2015



本文编号：3698915