基于CRISPR/Cas9技术构建基因敲减细胞系和小鼠

发布时间：2022-10-30 12:33

　　CRISPR/Cas9是近年来发现的新的一种基因编辑技术,CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）,即规律的、成簇的、间隔短回文重复,它是存在于古细菌和细菌中的多个短重复序列,为自身提供特异性保护机制,用来抵抗外源DNA的入侵。经过探索,这一系统已运用于科学研究,科研人员只需针对目的基因设计对应的sgRNA,将其连接到对应的载体上,转入所要研究的对象中,然后运用PCR和Western Blotting检测相应基因的表达。CRISPR/Cas9系统因其操作较简单、编辑效率较高、成本较低、耗时较短而被广泛运用到生物和医学的各个领域。本课题主要分为两个部分。一是基于CRISPR/Cas9技术建立MTMR14稳定敲减细胞株及后续表型分析。首先,我们设计了4对针对人源MTMR14的sgRNA,将其连接到PX458载体上,将其转染到293T细胞中,293T是一种工具细胞,易于转染和操作,然后通过测序和蛋白检测,我们得到了MTMR14基因敲减的293T细胞系。在成功搭建了CRISPR/Cas9技术平台后我们着重... 

【文章页数】：84 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
Part Ⅰ MTMR14稳定敲减细胞株的建立及表型分析
    第一章 绪论
        1.1 早期基因编辑技术
            1.1.1 RNAi技术
            1.1.2 ZFN技术
            1.1.3 TALEN技术
        1.2 CRISPR/Cas9技术
            1.2.1 CRISPR/Cas系统起源
            1.2.2 CRISPR/Cas分类
            1.2.3 CRISPR/Cas9作用机理
            1.2.4 CRISPR/Cas9的应用
                1.2.4.1 医学领域
                1.2.4.2 动物科学领域
                1.2.4.3 植物科学领域
                1.2.4.4 微生物学领域
        1.3 MTMR14研究进展
            1.3.1 概述
            1.3.2 MTMR14的发现
            1.3.3 MTMR14的基因和蛋白
            1.3.4 MTMR14的生物学功能
                1.3.4.1 MTMR14与CNM
                1.3.4.2 MTMR14与钙离子调节
                1.3.4.3 MTMR14与自噬
        1.4 本文构思
            1.4.1 选题缘由
            1.4.2 研究内容
            1.4.3 研究目的及意义
    第二章 实验材料、仪器和试剂
        2.1 实验材料
        2.2 实验仪器和耗材
            2.2.1 实验仪器
            2.2.2 实验耗材
        2.3 实验试剂
        2.4 溶液配制
            2.4.1 构载体所需溶液
            2.4.2 细胞培养所需溶液
            2.4.3 WesternBlotting所需溶液
            2.4.4 MTT所需溶液
            2.4.5 流式细胞术所需溶液
    第三章 实验方法
        3.1 构建基因敲减细胞系
            3.1.1 hMTMR14sgRNA序列的设计
            3.1.2 PX458-sgRNA表达载体的构建和鉴定
            3.1.3 细胞培养
                3.1.3.1 细胞复苏
                3.1.3.2 细胞换液与传代
                3.1.3.3 细胞冻存
            3.1.4 细胞转染
                3.1.4.1 提质粒
                3.1.4.2 Lipo-2000转染
                3.1.4.3 Lipo-3000转染
            3.1.5 流式细胞仪分选
            3.1.6 单细胞培养
            3.1.7 测序鉴定
                3.1.7.1 提取细胞基因组
                3.1.7.2 PCR扩增细胞基因组和测序
            3.1.8 错配酶酶切鉴定
            3.1.9 Western Blotting检测MTMR14的表达
                3.1.9.1 细胞总蛋白的提取
                3.1.9.2 Western Blotting
        3.2 MTT检测细胞生长速率
            3.2.1 细胞计数
            3.2.2 测定标准曲线
            3.2.3 测定细胞生长速率
        3.3 流式细胞术检测细胞周期
            3.3.1 细胞收集与固定
            3.3.2 细胞染色及检测
        3.4 Real-time PCR检测细胞周期调控因子转录水平
            3.4.1 总RNA的提取
            3.4.2 逆转录PCR
            3.4.3 Real-time PCR
        3.5 统计分析
    第四章 MTMR14基因敲减细胞系的建立
        4.1 构建MTMR14基因敲减的293T细胞
            4.1.1 引言
            4.1.2 分析PX458载体序列
            4.1.3 构建PX458-sgRNA表达载体
            4.1.4 细胞转染以及流式细胞分选
            4.1.5 PCR和测序分析流式分选细胞基因组序列
            4.1.6 PX458-sgRNA表达载体的靶向敲除效果检测
        4.2 构建基因敲减的A549细胞
            4.2.1 引言
            4.2.2 细胞转染
            4.2.3 分选细胞的基因组测序分析
            4.2.4 PX458-sgRNA表达载体的靶向敲除效果检测
        4.3 小结
    第五章 MTMR14基因敲减的A549细胞系表型分析
        5.1 引言
        5.2 实验结果与分析
            5.2.1 MTT检测MTMR14表达的减少对细胞增殖的影响
            5.2.2 流式细胞术检测细胞周期
            5.2.3 Real-timePCR检测细胞周期调控因子转录水平
        5.3 小结
    第六章 讨论与展望
Part Ⅱ 基于CRISPR/Cas9技术建立RhoA基因敲除小鼠
    第一章 前言
        1.1 CRISPR/Cas9建立基因敲除小鼠概述
        1.2 RhoA概述
        1.3 本文构想
    第二章 实验材料、仪器和试剂
        2.1 实验材料
        2.2 实验仪器
        2.3 实验试剂
    第三章 实验方法
        3.1 sgRNA和检测引物的设计
        3.2 sgRNA体外活性检测
            3.2.1 PCR扩增反应
            3.2.2 检测和回收PCR产物
            3.2.3 gRNA转录
            3.2.4 回收和提取gRNA
            3.2.5 用于酶切的dsDNA扩增和切胶回收
            3.2.6 spCas9/gRNA体外酶切反应
        3.3 体外转录sgRNA/Cas9mRNA
        3.4 超排卵与小鼠受精卵的获取
        3.5 小鼠受精卵显微注射sgRNA/Cas9mRNA
        3.6 胚胎移植
        3.7 利用PCR和测序对F0代小鼠进行基因型鉴定
    第四章 实验结果
        4.1 体外sgRNA活性检测
        4.2 体外转录sgRNA/Cas9mRNA
        4.3 显微注射
        4.4 胚胎移植
        4.5 基因型鉴定
        4.6 小结
    第五章 讨论与展望
参考文献
致谢
附录A 攻读学位期间所发表的学术论文目录


【参考文献】：
期刊论文
[1]应用RGS双荧光替代性报告载体提高CRISPR/Cas9对猪BMP15基因的打靶效率[J]. 王敏,石翾,黄翔,刘小凤,覃玉凤,刘小红,陈瑶生,何祖勇.  遗传. 2017(01)



本文编号：3698894