利用CRISPR/Cas基因筛选技术研究Wnt/β-catenin信号通路的调控因子

发布时间：2022-11-05 04:34

　　Wnt/β-catenin信号通路在进化中高度保守。在胚胎发育过程中,其在细胞分化、增殖、迁移等过程中发挥着关键作用。在成体组织中,其对成体干细胞自我更新能力的维持、组织的损伤修复发挥着重要的作用。Wnt信号的失调不但对肿瘤的发生至关重要,而且对晚期肿瘤的转移形成起到了关键作用。因此,Wnt信号通路是非常具有吸引力的抗肿瘤药物靶点。本课题的主要研究目标是系统性寻找参与Wnt信号通路的重要调控分子。本课题结合Wnt/β-catenin信号通路报告细胞系和CRISPR/Cas全基因组筛选技术,通过两轮筛选及生物信息学分析,寻找参与Wnt信号通路下游调控的信号分子。为了进一步验证筛选结果,选取多个筛选基因,并将其逐个在报告细胞中敲除。在基因敲除后的报告细胞内,通过RT-QPCR技术检测Wnt下游基因Axin2 mRNA的表达,通过WB技术检测β-catenin蛋白的表达,进而验证筛选得到的基因是否对Wnt信号通路的调控起到关键作用。第一轮筛选富集了460个基因,其中已知的Wnt信号分子占3.5%,第二轮富集了29个基因,已知的Wnt信号分子占20.7%。表明我们第二轮筛选更有效的富集了与Wn... 

【文章页数】：70 页

【学位级别】：硕士

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摘要
ABSTRACT
第1章 绪论
    1.1 WNT/β-CATENIN信号通路
        1.1.1 Wnt信号通路的类型
        1.1.2 经典Wnt信号通路
    1.2 WNT/β-CATENIN信号通路与疾病
    1.3 CRISPR / CAS系统
    1.4 基因筛选策略
    1.5 本课题的主要研究内容
第2章 材料和方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 细胞株
        2.1.2 抗体
        2.1.3 试剂与仪器
    2.2 实验方法
        2.2.1 细胞培养,传代和冻存
        2.2.2 细胞瞬时转染
        2.2.3 慢病毒包装和转染
        2.2.4 扩增全基因组敲除的g RNA文库
        2.2.5 质粒提取实验步骤
        2.2.6 3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)测细胞活力
        2.2.7 流式细胞术分选与分析
        2.2.8 苯酚/氯仿方法提取细胞基因组DNA
        2.2.9 聚合酶链式反应扩增目的片段
        2.2.10 磁珠纯化DNA片段
        2.2.11 二代测序及生物信息学分析
        2.2.12 构建表达g RNA和cas9的质粒
        2.2.13 Trizol法提取的细胞总的RNA
        2.2.14 RT-QPCR测基因表达
        2.2.15 蛋白质印迹法测蛋白水平的表达(Western Blot)
第3章 结果
    3.1 建立CRISPR/CAS筛选所需的细胞系
        3.1.1 建立Wnt/β-catenin信号通路报告细胞系
        3.1.2 建立稳定表达Cas9的报告细胞系
    3.2 CRISPR/CAS基因筛选系统的建立
        3.2.1 人类全基因组g RNA文库的分布
        3.2.2 慢病毒g RNA文库包装和感染
        3.2.3 流式分析基因敲除后细胞的GFP荧光强度的变化
        3.2.4 g RNA的建库以及质量控制
        3.2.5 生信分析原始g RNA文库与Baseline的差异
    3.3 第一轮筛选
    3.4 对富集的GRNA进行第二轮筛选
    3.5 两轮筛选的比较
    3.6 验证CRISPR/CAS筛选得到的信号分子
        3.6.1 第一次验证候选基因
        3.6.2 在给 CHIR 3um 的情况下再次验证候选基因
        3.6.3 检测候选基因敲除对Axin2表达的影响
        3.6.4 候选基因与疾病的关系
    3.7 讨论
结论
参考文献
致谢



本文编号：3701928