中药多糖为载体的基因传递及其诱导细胞重编程研究

发布时间：2022-11-10 22:02

　　谱系重编程在肝病治疗,特别是终末期肝病（End-stage liver disease,ESLD）治疗领域被深入研究。安全高效的基因载体是该技术成功应用的关键。当归多糖（Angelica sinensis polysaccharide,ASP）表面覆盖大量活性基团,易于被阳离子化修饰,是一种新型、安全、高效的基因载体,近年来被广泛应用于基因传递。本论文使用水提醇沉法制备ASP,选用聚乙烯亚胺（Polyethyleneimine,PEI）对ASP进行阳离子化修饰,利用阳离子化当归多糖（ASP-PEI）与质粒HNF1A之间的静电相互作用力,制得cASP-pHNF1A自组装纳米粒,并且进一步对该纳米粒介导的肝脏细胞重编程做了研究。实验结果显示,cASP-pHNF1A自组装纳米粒形态圆整,大小均一,细胞转染效率高。诱导的人源肝细胞（Induced human hepatocytes,ihHeps）能表达肝脏标志蛋白ALB,AAT,CK18,CK19和药物代谢酶CYP450,UGT,GST,摄取和排泄吲哚菁绿（Indocyanine Green,ICG）,储存糖原,摄取低密度脂蛋白（Low De... 

【文章页数】：100 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略词表
引言
第一章 综述
    1 肝病的概述及研究进展
    2 细胞疗法应用于肝病治疗研究进展
        2.1 原代肝细胞
        2.2 肝祖细胞
        2.3 干细胞
        2.4 谱系重编程
            2.4.1 病毒型基因载体介导的谱系重编程
            2.4.2 非病毒型基因载体介导的谱系重编程
            2.4.3 存在的问题和局限性
    3 天然多糖作为新型非病毒基因载体研究进展和展望
    4 本论文的研究意义与内容
        4.1 研究对象与意义
        4.2 研究思路与内容
第二章 中药多糖的提取、分离、纯化及结构解析
    1 仪器与试剂
        1.1 主要仪器
        1.2 主要试剂
    2 实验与方法
        2.1 当归药材的预处理
        2.2 当归粗多糖的提取
        2.3 当归多糖的纯化
            2.3.1 粗多糖除蛋白
            2.3.2 柱层析法
        2.4 当归多糖的结构解析
            2.4.1 分子量测定
            2.4.2 糖醛酸含量测定
            2.4.3 刚果红实验
            2.4.4 单糖组成
    3 结果与讨论
        3.1 当归多糖的纯化
            3.1.1 粗多糖除蛋白
            3.1.2 柱层析法
        3.2 当归多糖的结构解析
            3.2.1 分子量测定
            3.2.2 糖醛酸含量测定
            3.2.3 刚果红实验
            3.2.4 单糖组成
    4 本章小结
第三章 中药多糖的阳离子化修饰及表征
    1 仪器与试剂
        1.1 主要仪器
        1.2 主要试剂
    2 实验与方法
        2.1 当归多糖的阳离子化修饰
        2.2 阳离子化当归多糖(ASP-PEI)的表征
            2.2.1 Zeta电位测定
            2.2.2 元素分析
            2.2.3 伯氨基含量测定
            2.2.4 傅立叶红外光谱(FT-IR)分析
            2.2.5 核磁共振(NMR)分析
    3 结果与讨论
        3.1 Zeta电位测定
        3.2 元素分析
        3.3 伯氨基含量测定
        3.4 傅立叶红外光谱(FT-IR)分析
        3.5 核磁共振(NMR)分析
    4 本章小结
第四章 cASP-pHNF1A自组装纳米粒的制备、表征及细胞转导效率研究
    1 仪器与试剂
        1.1 主要仪器
        1.2 主要试剂
        1.3 主要溶液
    2 实验与方法
        2.1 cASP-pHNF1A自组装纳米粒的制备
            2.1.1 质粒DNA的制备
            2.1.2 质粒DNA的鉴定
            2.1.3 cASP-pHNF1A自组装纳米粒的制备
            2.1.4 cASP-pHNF1A自组装纳米粒携带基因能力的测定
        2.2 cASP-pHNF1A自组装纳米粒的表征
            2.2.1 Zeta电位测定
            2.2.2 粒径测定
            2.2.3 形态观察
            2.2.4 细胞毒性
        2.3 cASP-pHNF1A自组装纳米粒细胞转导效率的研究
            2.3.1 cASP-pHNF1A自组装纳米粒细胞转导效率的定性分析
            2.3.2 cASP-pHNF1A自组装纳米粒细胞转导效率的定量分析
    3 结果与讨论
        3.1 cASP-pHNF1A自组装纳米粒的制备
            3.1.1 质粒DNA的鉴定
            3.1.2 cASP-pHNF1A自组装纳米粒携带基因能力的测定
        3.2 cASP-pHNF1A自组装纳米粒的表征
            3.2.1 Zeta电位测定
            3.2.2 粒径测定
            3.2.3 形态观察
            3.2.4 细胞毒性
        3.3 cASP-pHNF1A自组装纳米粒细胞转导效率的研究
            3.3.1 cASP-pHNF1A自组装纳米粒细胞转导效率的定性分析
            3.3.2 cASP-pHNF1A自组装纳米粒细胞转导效率的定量分析
    4 本章小结
第五章 cASP-pHNF1A自组装纳米粒介导的体细胞重编程研究
    1 仪器与试剂
        1.1 主要仪器
        1.2 主要试剂
        1.3 主要溶液
    2 实验与方法
        2.1 人源包皮成纤维细胞(HFFs)的分离与培养
            2.1.1 HFFs细胞的原代培养
            2.1.2 HFFs细胞的传代培养
            2.1.3 HFFs细胞的冻存与复苏
        2.2 HFFs细胞重编程为诱导的人源肝细胞(ihHeps)
        2.3 ihHeps的鉴定
            2.3.1 细胞形态变化
            2.3.2 免疫荧光反应
            2.3.3 蛋白免疫印记(Western Blotting)
            2.3.4 实时荧光定量PCR
            2.3.5 吲哚菁绿(ICG)的摄取和分泌
            2.3.6 糖原的储存
            2.3.7 低密度脂蛋白(LDL)的摄取
    3 结果与讨论
        3.1 人源包皮成纤维细胞(HFFs)的分离与培养
        3.2 HFFs细胞重编程为人源肝细胞(ihHeps)
        3.3 ihHeps的鉴定
            3.3.1 免疫荧光反应
            3.3.2 蛋白免疫印迹(Western Blotting)
            3.3.3 实时荧光定量PCR
            3.3.4 吲哚菁绿(ICG)的摄取和分泌
            3.3.5 糖原的储存
            3.3.6 低密度脂蛋白(LDL)的摄取
    4 本章小结
全文总结与创新点
    一 全文总结
        1 中药多糖的提取、分离、纯化及结构解析
        2 中药多糖的阳离子化修饰及表征
        3 cASP-pHNF1A自组装纳米粒的制备、表征及细胞转导效率研究
        4 cASP-pHNF1A自组装纳米粒介导的体细胞重编程研究
    二 创新点
    三 展望
参考文献
致谢
攻读硕士期间已发表或完成的论文



本文编号：3705359