慢病毒介导的RNAi对佐剂性关节炎大鼠脊髓IL-33基因的沉默效应

发布时间：2017-05-16 10:11

  本文关键词：慢病毒介导的RNAi对佐剂性关节炎大鼠脊髓IL-33基因的沉默效应，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：第一章慢病毒介导RNA干扰对体外培养大鼠胶质瘤细胞IL-33基因的沉默效应目的构建IL-33基因RNA干扰慢病毒载体并转染体外培养的大鼠胶质瘤细胞,观察其沉默效应。方法1.针对大鼠IL-33基因特异性序列,设计3条IL-33-si RNA序列及1条阴性对照序列,合成包含各正义靶序列的互补DNA链,退火形成双链DNA,插入到经HpaⅠ和XhoⅠ剪切的GV118的慢病毒载体种,PCR筛选阳性克隆,DNA测序鉴定。与慢病毒包装质粒p Helper1.0、p Helper2.0转染至293T细胞,滴度测定后-80℃冰箱保存备用。2.慢病毒重组体转染体外培养的胶质瘤细胞C6,观察转染效率。3.倒置荧光显微镜下观察C6细胞的形态改变,Real-Time PCR检测慢病毒重组体对C6细胞IL-33m RNA的干扰效率。结果1.测序结果证实合成的寡核苷酸链插入正确,重组载体构建成功,测定慢病毒滴度为LV-IL33-RNAi(1)为1×109TU/ml;LV-IL33-RNAi(2)为8×108TU/ml;LV-IL33-RNAi(3)为1×109TU/ml。2.慢病毒重组体能成功转染至C6细胞,相对于阴性对照组,LVIL-33-RNAi(1),LV-IL-33-RNAi(2),LV-IL-33-RNAi(3)组转染至C6细胞后,IL-33m RNA表达水明降低,其中LV-IL33-RNAi(2)组敲减率最高达到了66.5%,其差异有统计学意义(P0.05)。结论成功构建了大鼠IL-33基因的RNA干扰慢病毒载体,其可使胶质瘤细胞C6的IL-33基因表达下调。这样为我们下一步动物体内实验奠定了基础。也为神经系统IL-33基因功能研究提供一种有效工具。第二章脊髓IL-33对佐剂性关节炎大鼠外周炎症及痛觉过敏的调控目的炎症组织的伤害性刺激会增加脊髓背角神经元的兴奋性即发生中枢敏化。神经元兴奋后产生的信号可返回调控外周炎症,具体机制尚未明确。最近一些研究表明,脊髓IL-33参与了中枢敏化介导疼痛反应。我们的目的是研究脊髓IL-33是否也参与了大鼠佐剂性关节炎的外周炎症反应及相关痛觉过敏。方法1.构建大鼠佐剂性关节炎模型,左侧足底皮下注射弗式完全佐剂(complete Freund’s adjuvant,CFA)100μl,CFA注射后2天,鞘内注射LV-sh RNA-IL-33和阴性对照病毒。于术前1天和术后6h、12h、24h(1天)、2天、3天、4天、7天、10天、14天、21天观察大鼠行为学变化,记录机械痛阈和热痛阈,测量足趾肿胀度。2.使用Western-blot技术评估CFA组大鼠1天、2天、3天、4天、7天、10天、14天、21天脊髓IL-33蛋白的表达改变,检测CFA+LVIL-33-RNAi组和CFA+LV-IL-33-NC组第14天、第21天脊髓IL-33蛋白表达的改变。取21天各组大鼠左侧踝关节,HE染色观察大鼠关节病理改变。结果1.相比sham组,CFA大鼠的机械痛阈和热痛阈明显下降(P0.01),而足趾肿胀程度明显增加(P0.01)。2.外周炎症上调了脊髓IL-33蛋白的表达,LV-IL-33-RNAi组第14天和第21天,脊髓IL-33蛋白水平下调,而LV-IL-33-NC组无下调变化。结论外周炎症上调了脊髓IL-33蛋白的表达,鞘内注射LV-sh RNA-IL-33能下调IL-33蛋白的表达。因此,抑制脊髓IL-33的表达对外周炎症性疾病可能是一种潜在的治疗方法。
【关键词】：IL-33 慢病毒介导RNA干扰 胶质瘤细胞C6 IL-33 佐剂性关节炎 脊髓 慢病毒介导RNA干扰
【学位授予单位】：新疆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R614
【目录】：

• 中文摘要5-7
• ABSTRACT7-14
• 中英文缩略词表14-15
• 前言15-17
• 第一章 慢病毒介导RNA干扰对体外培养大鼠胶质瘤细胞IL-33基因的沉默效应17-40
• 引言17-18
• 1 实验材料18-20
• 1.1 主要仪器与设备18
• 1.2 主要试剂与耗材18-19
• 1.3 质粒和细胞19-20
• 2 实验方法20-30
• 2.1 IL-33基因RNA干扰慢病毒载体的构建和鉴定20-26
• 2.1.1 siRNA靶点设计20
• 2.1.2 大鼠IL33siRNA的设计与合成20-21
• 2.1.3 双链DNA制备21
• 2.1.4 双链低聚体与载体的连接21-22
• 2.1.5 转化22
• 2.1.6 阳性克隆的菌落PCR鉴定22-23
• 2.1.7 阳性质粒抽提23-24
• 2.1.8 IL-33基因shRNA慢病毒载体的包装24-25
• 2.1.9 慢病毒的收集与浓缩25-26
• 2.1.10 滴度稀释法测定慢病毒滴度26
• 2.2 重组慢病毒载体对体外培养大鼠胶质瘤细胞IL-33基因的干扰效应26-29
• 2.2.1 重组慢病毒靶细胞转染26-27
• 2.2.2 R./0-T12.3PCR检测转染重组后C6细胞IL-33MRNA表达水平的变化27-29
• 2.3 统计学处理29-30
• 3 实验结果30-37
• 3.1 菌落PCR鉴定结果（图 1-3）30-31
• 3.2 构建的RNA干扰重组质粒的测序结果31-32
• 3.3 慢病毒包装和滴度测定结果32-34
• 3.4 慢病毒介导RNA干扰对C6细胞荧光观测结果34-35
• 3.5 慢病毒介导RNA干扰对C6细胞IL-332RNA的沉默效应35-37
• 4 讨论37-39
• 4.1 RNA1技术应用的特点37
• 4.2 慢病毒介导RNA1的特点37-38
• 4.3 慢病毒载体转染效率验证38-39
• 5 结论39-40
• 5.1 成功构建了大鼠IL-33基因RNA干扰慢病毒载体39
• 5.2 体外转染C6细胞，验证其干扰效率，并筛选出有效靶点39-40
• 第二章 脊髓IL-33对佐剂性关节炎大鼠外周炎症及痛觉过敏的调控40-64
• 引言40-41
• 1 实验材料41-45
• 1.1 实验动物41
• 1.2 主要设备和仪器41-42
• 1.3 主要试剂与耗材42-43
• 1.4 主要实验试剂配制43-45
• 2 实验方法45-53
• 2.1 动物实验分组45
• 2.2 鞘内置管45-46
• 2.3 动物模型构建46-47
• 2.4 疼痛相关行为学评估47-48
• 2.4.1 机械痛阈检测47
• 2.4.2 热痛阈值检测47-48
• 2.5 组织取材48
• 2.6 Western blot 检测脊髓 IL-33 蛋白的表达48-51
• 2.6.1 蛋白提取48-49
• 2.6.2 BCA法测定蛋白浓度49
• 2.6.3 分装蛋白49
• 2.6.4 凝胶配制49
• 2.6.5 SDS-PAGE凝胶电泳49-50
• 2.6.6 湿法转膜50
• 2.6.7 封闭50
• 2.6.8 孵育一抗50
• 2.6.9 洗膜50
• 2.6.10 孵育二抗50-51
• 2.6.11 洗膜51
• 2.6.12 ECL发光51
• 2.7 关节炎评估51-52
• 2.7.1 足趾、关节体积测定51
• 2.7.2 关节病理学组织检查和评分51-52
• 2.8 统计学处理52-53
• 3 实验结果53-60
• 3.1 佐剂性关节炎大鼠模型的建立及评价53-57
• 3.1.1 模型大鼠机械痛阈的变化53-54
• 3.1.2 模型大鼠热痛阈的变化54
• 3.1.3 模型大鼠足趾、关节肿胀的变化54-55
• 3.1.4 模型大鼠关节病理学改变55-56
• 3.1.5 模型大鼠脊髓IL-33蛋白水平表达变化56-57
• 3.2 慢病毒重组体沉默IL-33基因对佐剂性关节炎大鼠脊髓IL-33蛋白水平的影响57-60
• 4 讨论60-63
• 4.1 佐剂性关节炎大鼠模型的构建60
• 4.2 脊髓IL-33对佐剂性关节炎大鼠外周炎症和痛觉过敏的可能影响60-61
• 4.3 中枢对外周炎症的调控61-63
• 5 结论63-64
• 5.1 成功构建佐剂关节炎大鼠模型，外周炎症上调了脊髓IL-33蛋白的表达63
• 5.2 鞘内注射LV-4:RNA-IL-33可以抑制脊髓IL-33蛋白水平的表达，L-33可能参与了外周炎症的调控63-64
• 全文结论64-65
• 参考文献65-69
• 综述69-79
• 参考文献74-79
• 攻读硕士学位期间主要成果79-80
• 致谢80-81
• 导师评阅表81

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