miR-320a对结直肠癌细胞生物学行为的影响及下游靶基因鉴定

发布时间：2022-11-12 09:55

　　目的:结直肠癌是目前临床常见的一种恶性肿瘤,是第三大最常见的导致高死亡率的癌症。结直肠癌每年约造成近50万人死亡,占全球癌症发病率的近10%和所有癌症死亡的8%。结直肠癌的发病机制涉及多种基因,多个因子,多种信号通路,其发生发展是多因素相互调控的结果发病机制十分复杂。microRNA是一种小的非编码RNA,能够识别并结合其目标mRNA的部分互补序列,导致mRNA的降解或其翻译的抑制。越来越多的研究表明,mRNA在不同的癌症中通常表现为异常表达,因而在肿瘤中发挥着促癌或者抑癌的作用。现有研究表明,miR-320a在胃癌、非小细胞肺癌等多种肿瘤中表达异常下调,其作为一种肿瘤抑制性miRNA,但是关于其在结直肠癌中的研究却相对很少。因此,鉴定miR-320a对结直肠癌细胞生物学行为的影响及下游靶基因鉴定是探索结直肠癌发病机制的一个重要方向。方法:miR-320a过表达病毒感染DLD1与SW620两株结直肠癌细胞,荧光显微镜观察荧光表达情况并进行qRT-PCR实验验证miR-320a过表达水平。CCK-8实验验证结直肠癌细胞的增殖能力、细胞克隆形成实验验证结直肠癌细胞的克隆形成能力、划痕实验验... 

【文章页数】：85 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 绪论
    1.1 结直肠癌
        1.1.1 结直肠癌的概况
        1.1.2 结直肠癌的研究进展及治疗方法
        1.1.3 结直肠癌的危险因素分析
    1.2 Micro RNA与miR -320a的研究进展
        1.2.1 micro RNA在肿瘤发生发展中的作用
        1.2.2 miR-320a的研究进展
    1.3 Sp1的研究进展
        1.3.1 Sp1概况
        1.3.2 Sp1在肿瘤中的研究概况
        1.3.3 Sp1与结直肠癌
    1.4 MACC1的研究进展
    1.5 FOXQ1的研究进展
    1.6 本课题的选题依据、研究方案、研究目的
        1.6.1 选题依据
        1.6.2 研究方案
        1.6.3 研究目的
第二章实验材料与方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 细胞系
        2.1.2 实验试剂及耗材
        2.1.3 主要实验仪器
    2.2 实验方法
        2.2.1 细胞复苏、传代
            2.2.1.1 细胞复苏
            2.2.1.2 细胞传代
        2.2.2 miR-320a稳定过表达细胞株的构建
            2.2.2.1 慢病毒表达载体的构建
            2.2.2.2 慢病毒表达质粒的筛选及扩增
            2.2.2.3 慢病毒表达载体质粒病毒包装、浓缩
            2.2.2.4 慢病毒感染细胞及阳性细胞的筛选
            2.2.2.5 qRT-PCR验证稳转细胞miR-320a过表达情况
        2.2.3 细胞功能实验
            2.2.3.1 细胞增殖实验
            2.2.3.2 细胞克隆形成实验
            2.2.3.3 细胞迁移实验
            2.2.3.4 细胞Transwell侵袭实验
        2.2.4 免疫印迹（Western Blotting）实验
            2.2.4.1 细胞总蛋白提取
            2.2.4.2 BCA法测定蛋白浓度
            2.2.4.3 蛋白免疫印迹测定蛋白表达情况
        2.2.5 实时荧光定量实验（qRT-PCR）
            2.2.5.1 RNA提取
            2.2.5.2 RNA逆转录
            2.2.5.3 实时荧光定量（qRT-PCR）
        2.2.6 双荧光素酶报告系统验证靶基因
            2.2.6.1 双荧光素酶报告基因载体构建
            2.2.6.2 荧光素酶报告基因检测的操作方法
第三章 实验结果
    3.1 第一部分实验：miR-320a稳定过结直肠癌细胞系的构建
        3.1.1 miR-320a过表达组质粒与NC对照组质粒的扩增与检测
        3.1.2 稳定过表达细胞系的构建
        3.1.3 Real-time PCR检测结直肠癌DLD1细胞与SW620细胞稳定过表达miR-320a的表达情况
    3.2 第二部分实验：miR-320a稳定过表达对结直肠癌的生物学影响
        3.2.1 CCK-8实验验证miR-320a稳定过表达抑制结直肠癌DLD1细胞和SW620细胞的生长
        3.2.2 克隆形成实验验证miR-320a稳定过表达抑制结直肠癌DLD1细胞和SW620细胞的克隆形成能力
        3.2.3 细胞划痕实验验证miR-320a稳定过表达抑制结直肠癌DLD1细胞和SW620细胞的迁移能力
        3.2.4 Tranwell入侵实验验证miR-320a稳定过表达抑制结直肠癌DLD1细胞和SW620细胞的侵袭能力
    3.3 第三部分实验:miR-320a下游靶基因的鉴定
        3.3.1 相关蛋白变化及m RNA变化
        3.3.2 荧光素酶报告系统验证靶基因
第四章 结果分析与结论
    4.1 结果分析
    4.2 结论
致谢
参考文献
附录
    附录 A：攻读学位期间发表论文
    附录 B：攻读学位期间参与科研项目
    附录 C：缩略表


【参考文献】：
期刊论文
[1]结直肠癌与膳食纤维相关饮食因素病例对照研究[J]. 袁平,李文燕,林修全,杨眉,刘星,陈仲武,林仲,陈铁晖,林永添,王慧.  中国公共卫生. 2016(12)
[2]Micro RNA-320 family is downregulated in colorectal adenoma and affects tumor proliferation by targeting CDK6[J]. Toshihiro Tadano,Yoichi Kakuta,Shin Hamada,Yosuke Shimodaira,Masatake Kuroha,Yoko Kawakami,Tomoya Kimura,Hisashi Shiga,Katsuya Endo,Atsushi Masamune,Seiichi Takahashi,Yoshitaka Kinouchi,Tooru Shimosegawa.  World Journal of Gastrointestinal Oncology. 2016(07)
[3]miRNA-199a-5p通过SP1调节ERK5抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞侵袭的机制[J]. 翟丽敏,杨硕,李文通.  临床与实验病理学杂志. 2015(09)
[4]Colorectal cancer: From prevention to personalized medicine[J]. Gemma Binefa,Francisco Rodríguez-Moranta,àlex Teule,Manuel Medina-Hayas.  World Journal of Gastroenterology. 2014(22)
[5]microRNA与肿瘤关系的研究[J]. 冯琼,雷章,卢宏达.  中华临床医师杂志(电子版). 2012(15)



本文编号：3706155