一种高R-选择性水解R,S-甲霜灵的酯酶基因的克隆表达及表征

发布时间：2022-11-12 10:56

　　【目的】将一种可以高选择性水解R-甲霜灵的新脂酶基因,在大肠杆菌中进行克隆和表达,并研究重组脂酶的性质。【方法】根据已知的目标酯酶N端10个氨基酸序列,在已测序的Albibacters sp.zjut528基因组中找到相匹配的一个酯酶基因,它全长969bp,编码322个氨基酸,将该基因命名为RMest。通过引物扩增得到该基因的DNA片段,将它与表达载体pET-28a（+）连接后,转化大肠杆菌BL21Gold（DE3）,构建重组菌,IPTG诱导表达该酯酶,并用Ni²⁺亲和层析介质进行纯化。【结果】在重组菌RMest-pET-28a （+）-E. coli BL21 Gold （DE3）中成功表达了重组酯酶RMesterase,大小约为46 kDa。用胞内重组酶液催化水解R,S-甲霜灵,底物浓度10 g/L,反应6 h,底物转化率为49.8%,产物（甲霜灵酸）的ee_p为99.3%,对底物的对映体R-构型具有专一（选择）性。该酶最适温度和pH分别为40℃和pH 9.0。该酶的活性受到产物甲醇的抑制。通过Blast+在Uniprot KB数据库中搜寻... 

【文章页数】：13 页

【文章目录】：
1 材料和方法
    1.1 材料
        1.1.1 试剂：
        1.1.2 培养基：
    1.2 甲霜灵的分析方法
    1.3 酯酶基因的扩增和重组菌的构建
    1.4 酯酶基因RMest的表达和SDS-PAGE分析
    1.5 重组蛋白的纯化
    1.6 重组酶RMesterase的酶学性质
        1.6.1 酶的立体选择性：
        1.6.2 温度和p H对酶的活性和稳定性的影响：
        1.6.3 酶反应动力学测定：
        1.6.4 甲醇浓度对酶活的影响：
2 结果和分析
    2.1 在Albibacters sp.zjut528菌株基因组中寻找目标酯酶基因
    2.2 目标酯酶基因RMest的克隆和表达
    2.3 重组蛋白的纯化
    2.4 重组酯酶RMesterase的酶学性质
        2.4.1 酶的立体选择性：
        2.4.2 温度和p H对酶活性及稳定性的影响：
        2.4.3 甲醇浓度对酶活性的影响：
        2.4.4 重组酶的酶反应动力学：
    2.5 酯酶RMest与其他蛋白的序列比对
        2.5.1 酯酶RMest与数据库中其他蛋白的氨基酸序列比对及进化树的构建：
        2.5.2 酯酶RMest与EHest (水解甲霜灵中间体MAP)的氨基酸序列比对和催化性质比较：
3 讨论
4 结论


【参考文献】：
期刊论文
[1]生物法拆分外消旋甲霜灵制备R-甲霜灵[J]. 张朝晖,张利坤,陆跃乐.  化工学报. 2017(11)
[2]不对称水解（R,S）-2,6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯新菌种的分离鉴定及酯酶基因的克隆、表达[J]. 卢亚南,张朝晖,张利坤,陆跃乐.  微生物学报. 2016(08)
[3](±)-N-（2,6-二甲苯基）-丙氨酸甲酯的脂肪酶酶促水解拆分方法[J]. 黄丽琴,杨红.  南京农业大学学报. 2007(04)
[4]酶法拆分（±）-N-（2,6-二甲苯基）-丙氨酸甲酯[J]. 黄丽琴,陈道文,杨红.  有机化学. 2005(12)
[5]精甲霜灵与外消旋体甲霜灵对掘氏疫霉菌的抑菌活性比较[J]. 刘西莉,马安捷,林吉柏,刘鹏飞.  农药学学报. 2003(03)

博士论文
[1]脂肪酶催化拆分N取代苯基α氨基丙酸的研究[D]. 郑良玉.吉林大学 2004

硕士论文
[1]微胶囊法固定脂肪酶及拆分手性胺的研究[D]. 王世辉.吉林大学 2010
[2]精甲霜灵的合成研究[D]. 王岩.吉林大学 2008



本文编号：3706239