利用CRISPR/Cas9系统建立兔基因编辑技术的初步研究

发布时间：2022-11-12 13:39

　　利用基因敲除的实验动物我们可以直接检测疾病病理发生发展的过程,揭示基因、细胞组织结构与病因症状之间的关系。转基因兔已成为基因功能研究、人类疾病模型建立和高价值药用蛋白生产的重要工具。小鼠的Rosa26基因座已被广泛应用于外源基因的定点整合。近年来,关于猪的Rosa26位点也有相关学者进行了研究,并成功培育了转基因猪。小鼠的第11号染色体上存在一个安全位点,在2010年时该位点被斯坦福大学的研究团队成功分离并鉴定出来,命名为hipp11位点,简称H11位点。该位点位于Drg1基因的9号外显子和Eif4enif1基因的19号外显子之间,大小约5kb。由于位于间隔序列中,因此有很高的安全性,不容易被基因沉默,在多种细胞中都可以表达。目的:本研究以家兔为研究对象,利用CRISPR/Cas9系统,目的是改进兔遗传操作体系,建立成熟高效的兔基因敲除平台,对基因工程兔的推广应用具有重要意义。为基因功能研究、人类疾病动物模型和高价值蛋白乳腺生物反应器研制提供新手段、新方法。方法:⑴利用CRISPR/Cas9基因编辑系统根据家兔的MSTN基因构建敲除载体,在细胞水平验证其敲除效率。⑵通过生物信息学鉴定家... 

【文章页数】：63 页

【学位级别】：硕士

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中文摘要
ABSTRACT
主要符号表
引言
第一章 文献综述
    1.1 基因组定点编辑技术
        1.1.1 工程核酸酶精确的编辑基因
        1.1.2 Cas9: RNA介导的基因组编辑
        1.1.3 与其他基因组编辑技术的比较
        1.1.4 Cas9 系统的局限性
    1.2 肌肉生长抑制素基因的研究进展
        1.2.1 MSTN基因的概述
        1.2.2 MSTN基因的调控及生物学功能
    1.3 友好位点的研究进展
        1.3.1 H2-Tw3位点
        1.3.2 Hprt位点
        1.3.3 Rosa26位点
        1.3.4 Hipp11 (H11)位点
    1.4 超数排卵的研究
第二章 CRISPR介导的兔体细胞基因敲除研究
    1 材料与方法
        1.1 主要试剂及主要试剂配制
            1.1.1 主要试剂
            1.1.2 主要试剂配制
        1.2 主要仪器
        1.3 引物序列及测序
        1.4 试验方法
            1.4.1 试验设计方案
            1.4.2 CRISPR/Cas9作用靶点确定及sgRNA的设计与合成
            1.4.3 Cas9表达载体的构建
            1.4.4 兔胚胎成纤维细胞的分离及培养
            1.4.5 CRISPR/Cas9去内毒素质粒的提取
            1.4.6 电转染家兔胚胎成纤维细胞
    2 结果与分析
        2.1 靶位点的确定及sgRNA设计
        2.2 Cas9/gRNA表达载体的构建和鉴定
        2.3 载体构建测序结果
        2.4 EGFP的表达及转染效率
        2.5 Cas9/gRNA敲除效率
    3 讨论
    4 结论
第三章 CRISPR介导GFP在兔体细胞定点整合研究
    1 材料和方法
        1.1 主要试剂
        1.2 主要仪器
        1.3 引物序列及测序
        1.4 试验方法
            1.4.1 试验设计方案
            1.4.2 序列比对
            1.4.3 sgRNA的设计和制备
            1.4.4 构建CRISPR/Cas9敲除载体
            1.4.5 引物设计
            1.4.6 同源打靶载体的构建
            1.4.7 兔胚胎成纤维细胞的复苏
            1.4.8 嘌呤霉素筛选兔胚胎成纤维细胞浓度确定
            1.4.9 敲除载体与同源打靶载体共转染兔胚胎成纤维细胞
            1.4.10 嘌呤霉素筛选细胞
            1.4.11 打靶细胞的检测
    2 结果与分析
        2.1 猪与小鼠与人的H11位点周围环境序列比对结果
        2.2 家兔基因组鉴定小鼠Rosa 26 的同源性
        2.3 CRISPR/Cas9的构建和活性分析
        2.4 同源打靶载体的构建
            2.4.1 pIRES2 -ZsGreen1-Puro载体的构建
            2.4.2 pIRES2 -ZsGreen1-H11- Puro-3’Arm和pIRES2 -ZsGreen1-Rosa26- Puro-3’Arm载体的构建
            2.4.3 终载体pIRES2 -ZsGreen1-H11-Puro和pIRES2 -ZsGreen1-Rosa26-Puro
        2.5 细胞实验结果
            2.5.1 嘌呤霉素最佳浓度的筛选
            2.5.2 敲除载体与同源打靶载体共转染兔胚胎成纤维细胞
        2.6 打靶细胞的检测
    3 讨论
    4 结论
第四章 兔胚胎的高效制备
    1 材料和方法
        1.1 材料
            1.1.1 试验动物
            1.1.2 试验药品和试验器械
        1.2 家兔超数排卵的方法
            1.2.1 PMSG+HCG
            1.2.2 FSH+HCG
            1.2.3 原核期供体兔胚胎的采集
            1.2.4 统计分析
    2 结果
        2.1 不同剂量PMSG的超排效果
        2.2 不同超排处理方法对母兔超排效果的影响
    3 讨论
        3.1 不同剂量PMSG的超排效果
        3.2 不同超排方法对母兔超排效果的影响
    4 结论
参考文献
导师评阅表


【参考文献】：
期刊论文
[1]吉富罗非鱼MSTN基因结构及其多态性与生长性状的相关性[J]. 唐永凯,李建林,俞菊华,陈雪峰,李红霞.  中国水产科学. 2010(01)
[2]品种及兔龄对家兔超数排卵的影响[J]. 唐修君,陈丽,邹海军,王杏龙.  甘肃畜牧兽医. 2007(02)
[3]家兔超数排卵的研究[J]. 杨小淦,江明生,卢晟盛,朱佳杰,任子利,陆阳清,张明,卢克焕.  广西农业生物科学. 2006(S1)
[4]中国大白兔的超数排卵效果比较[J]. 丁志丽,戴荣亮,周俊波,王杏龙.  河南畜牧兽医. 2005(11)
[5]电穿孔导入绿色荧光蛋白基因于绵羊胎儿成纤维细胞研究[J]. 王海,陆泉枝,连正兴,李宁,吴常信.  中国畜牧杂志. 2004(02)
[6]兔超数排卵的比较试验[J]. 刘亚,张运海,章美玲,李东伟,赵焕,谢振宣,王希春.  黑龙江畜牧兽医. 2003(04)
[7]用不同方法对不同年龄的家兔超排效果比较[J]. 胡小九,孙新明,王炜.  动物医学进展. 2001(02)
[8]影响兔超数排卵因素的研究[J]. 廉颖,李劲松,朱子玉,廉莉,吴昱琪.  中国兽医科技. 2001(04)
[9]两种剂量的PMSG对兔超数排卵效果的影响[J]. 王海霞,贺桂馨,李武,张贵学.  黑龙江动物繁殖. 1997(03)
[10]超数排卵及其存在的问题[J]. 谭景和,秦■春.  黑龙江畜牧兽医. 1987(05)

硕士论文
[1]基于CRISPR/Cas9系统的基因打靶研究[D]. 刘倩男.河南大学 2015
[2]家兔超数排卵影响因素的研究[D]. 金虎.延边大学 2006



本文编号：3706471