SlMYB41基因的克隆及其在番茄低温胁迫响应中的功能分析

发布时间：2022-12-03 22:13

　　温度是影响作物生长、发育及产量的重要环境因素之一。番茄、黄瓜、玉米等一些起源于热带或亚热带的作物对低温胁迫极其敏感。在我国北方设施蔬菜栽培和保护地生产中经常发生低温危害,使作物的生长发育遭受破坏,导致产量和品质的下降。为了应对低温胁迫,植物进化出了许多适应性的生理和生化机制。近年来,随着研究的不断深入,关于植物响应低温胁迫的机理取得了很大的进展。ICE-CBF-COR信号通路被认为在植物低温胁迫应答中发挥重要作用,多种转录因子参与其中并起关键调控作用。MYB转录因子是植物中最大的转录因子家族之一,在植物生长发育的各个阶段均起调控作用,并且也参与了植物对环境胁迫的响应过程。我们从实验室前期的低温转录组中发现SlMYB41基因受低温诱导明显,且尚未见其在低温胁迫下作用机制的研究报道。因此,本研究拟探讨SlMYB41转录因子在番茄低温响应中的功能及作用机制,旨在为培育抗低温的番茄新品种提供基因资源。本研究克隆了一个番茄MYB转录因子（SlMYB41）,并转化番茄,获得过表达和RNAi株系,探讨了低温胁迫下SlMYB41的功能。主要研究结果如下:（1）从番茄叶片中分离得到SlMYB41（Sol... 

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Abstract
1 前言
    1.1 低温对植物产生的影响
        1.1.1 低温胁迫对植物膜系统的影响
        1.1.2 低温胁迫对植物渗透调节物质的影响
        1.1.3 低温胁迫对植物抗氧化系统的影响
        1.1.4 低温胁迫对光合作用的影响
        1.1.5 低温信号通路的研究进展
    1.2 MYB转录因子的研究进展
        1.2.1 MYB转录因子的结构及分类
        1.2.2 MYB转录因子的功能
            1.2.2.1 MYB转录因子在植物生长发育中的功能
            1.2.2.2 MYB转录因子在植物生物和非生物胁迫响应中的功能
    1.3 本研究的目的与意义
2 材料方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 材料的培养和处理
        2.1.3 菌株及载体
        2.1.4 生化试剂
        2.1.5 PCR引物
        2.1.6 实验用培养基
    2.2 实验方法
        2.2.1 植物总RNA的提取
        2.2.2 cDNA第一条链合成
        2.2.3 SlMYB41基因的克隆
        2.2.4 目的片段的回收
        2.2.5 目的片段与克隆载体的连接
        2.2.6 转化大肠杆菌
        2.2.7 阳性克隆的筛选
        2.2.8 质粒提取
        2.2.9 双酶切鉴定测序
        2.2.10 真核表达载体的构建
        2.2.11 农杆菌转化
        2.2.12 农杆菌介导的番茄遗传转化
        2.2.13 转基因番茄的筛选鉴定
            2.2.13.1 CTAB法提取植物基因组
            2.2.13.2 SDS法提取植物基因组DNA
            2.2.13.3 PCR鉴定
            2.2.13.4 qRT-PCR检测转基因株系的表达量
        2.2.14 SlMYB41蛋白的亚细胞定位
            2.2.14.1 SlMYB41-GFP表达载体的构建
            2.2.14.2 瞬时转化烟草
        2.2.15 相关生理指标的测定
            2.2.15.1 抗氧化酶活性的测定
            2.2.15.2 丙二醛(MDA)含量测定
            2.2.15.3 游离脯氨酸含量测定
            2.2.15.4 氧自由基含量测定
            2.2.15.5 过氧化氢含量测定
            2.2.15.6 逆境伤害程度测定
        2.2.16 SlMYB41转录激活活性验证
            2.2.16.1 表达载体的构建
            2.2.16.2 酵母感受态细胞的制备(乙酸锂法)
            2.2.16.3 酵母感受态细胞转化
            2.2.16.4 转录激活活性的鉴定
        2.2.17 转录组测序
        2.2.18 数据分析
3 结果分析
    3.1 SlMYB41基因的克隆及序列分析
        3.1.1 SlMYB41基因的克隆
        3.1.2 SlMYB41蛋白的序列分析
    3.2 SlMYB41蛋白的亚细胞定位
    3.3 SlMYB41的转录激活活性验证
        3.3.1 SlMYB41-BD载体的构建
        3.3.2 SlMYB41转录激活活性的检测
    3.4 SlMYB41基因的表达模式分析
        3.4.1 SlMYB41基因在番茄不同器官中的表达分析
        3.4.2 SlMYB41基因在不同非生物胁迫下的表达分析
    3.5 SlMYB41基因在番茄中的遗传转化
        3.5.1 SlMYB41基因表达载体的构建
        3.5.2 SlMYB41转基因株系的筛选鉴定
    3.6 SlMYB41的表达影响番茄的低温抗性
        3.6.1 SlMYB41过表达株系对低温敏感,RNAi株系低温抗性增强
        3.6.2 低温下SlMYB41的表达影响植株的H_2O_2含量
        3.6.3 低温下SlMYB41的表达影响番茄抗氧化酶活性
        3.6.4 低温下SlMYB41的表达影响细胞膜的完整性
        3.6.5 低温下SlMYB41的表达影响番茄体内游离脯氨酸的积累
    3.7 过表达株系与野生型株系低温处理下的转录组测序分析
        3.7.1 测序质量分析
        3.7.2 差异表达基因分析
        3.7.3 差异表达基因的GO注释分析
        3.7.4 差异表达基因的KEGG富集分析
        3.7.5 低温和清除ROS相关基因表达分析
4 讨论
    4.1 SlMYB41基因是一个R2R3型的MYB转录因子
    4.2 SlMYB41调控番茄低温抗性的生理机制
    4.3 SlMYB41调控番茄低温抗性的可能的分子机制
5 结论
参考文献
致谢
攻读学位期间发表的论文


【参考文献】：
期刊论文
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[7]膜脂组成与植物抗冷性的关系及其分子生物学研究进展[J]. 陈娜,郭尚敬,孟庆伟.  生物技术通报. 2005(02)
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博士论文
[1]番茄R2R3MYB转录因子家族鉴定及SlMYB41和SlMYB64基因功能研究[D]. 赵盼盼.山东农业大学 2017



本文编号：3707080