哈维氏弧菌ygjD基因定点突变及酶学性质研究
发布时间：2023-01-06 08:33
糖蛋白酶（Glycoprotease,Gcp）及其同源蛋白是一类存在于细菌、古菌和真核生物细胞内的保守蛋白,在细胞内发挥重要作用。YgjD是细菌细胞中的一种糖蛋白酶,是细菌适应环境和生存所必需的蛋白之一。最近发现YgjD与细胞内的另外2种蛋白YjeE和YeaZ形成复合物,在细胞内N~6-苏氨酰氨甲酰腺苷酸-tRNA（tRNA N~6-threonylcarbamoyladenosine）合成过程中发挥重要作用。本文对哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）的YgjD蛋白进行了表达、纯化和酶学性质研究,利用定点突变研究了YgjD蛋白的酶活性位点,进行了YgjD重组蛋白的促细菌生长和细胞复苏研究,主要研究结果如下:将含哈维氏弧菌ygjD基因的重组质粒pET-28a-ygjD在大肠杆菌进行了高效表达,用Ni亲和层析柱纯化获得YgjD重组蛋白,分别以牛血清白蛋白、ATEE、BTEE和BAPNA为底物测定了重组YgjD的蛋白水解酶活性,发现YgjD对牛血清白蛋白没有明显水解作用,但对ATEE、BTEE和BAPNA有明显水解活性,酶的比活力分别为59000 U/mg、53700 U/mg和810...
【文章页数】：61 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第1章 绪论
1.1 哈维氏弧菌概述
1.2 细菌活的非可培养状态(VBNC)
1.2.1 VBNC状态细菌形成及其影响
1.2.2 VBNC状态细菌检测及其可培养化
1.2.3 复苏促进因子(Rpf)
1.3 糖蛋白酶Gcp与 YgjD蛋白简述
1.3.1 糖蛋白酶(Gcp)简述
1.3.2 YgjD蛋白简述
1.4 本课题研究意义及目的
第2章 哈维氏弧菌YgjD蛋白纯化、酶活与性质研究
2.1 材料与方法
2.1.1 菌株与质粒
2.1.2 培养基、试剂及仪器
2.1.3 哈维氏弧菌ygjD基因表达及蛋白纯化
2.1.4 SDS-PAGE电泳检测
2.1.5 蛋白质浓度测定
2.1.6 YgjD蛋白酶活性测定
2.1.7 YgjD蛋白酶活性影响因素
2.1.8 重组YgjD对牛血清白蛋白水解能力研究
2.1.9 SDS-PAGE技术分析YgjD与 YeaZ蛋白体外作用
2.1.10 酵母双杂交技术分析YgjD与 YeaZ蛋白体内作用
2.2 结果与分析
2.2.1 YgjD重组蛋白的纯化及SDS-PAGE鉴定
2.2.2 YgjD重组蛋白的酶活性
2.2.3 YgjD蛋白酶活性影响因素
2.2.4 YgjD重组蛋白对牛血清白蛋白水解作用
2.2.5 SDS-PAGE技术分析YgjD与 YeaZ蛋白体外作用
2.2.6 酵母双杂交技术分析YgjD与 YeaZ体内作用
2.3 讨论
第3章 ygjD基因定点突变体构建、表达及性质研究
3.1 材料与方法
3.1.1 菌株及质粒
3.1.2 主要试剂与仪器
3.1.3 ygjD基因突变构建
3.1.4 突变体表达质粒的酶切与序列鉴定
3.1.5 感受态细胞的制备
3.1.6 重组质粒的转化与抽提
3.1.7 YgjD突变蛋白表达与纯化
3.1.8 纯化的YgjD突变蛋白浓度测定
3.1.9 纯化的YgjD突变蛋白蛋白酶活性测定
3.2 结果与分析
3.2.1 YgjD突变蛋白表达及纯化
3.2.2 纯化的YgjD突变体蛋白的浓度
3.2.3 纯化的YgjD突变体蛋白酶活性
3.3 讨论
第4章 YgjD及突变蛋白的促生长和促复苏作用研究
4.1 材料与方法
4.1.1 菌株与培养基
4.1.2 主要试剂与仪器
4.1.3 重组蛋白YgjD对革兰氏阴性细菌的促生长作用
4.1.4 重组蛋白YgjD对革兰氏阳性细菌的促生长作用
4.1.5 低温条件下YgjD蛋白对哈维氏弧菌SF-1 的促生长作用
4.1.6 YgjD及突变蛋白对哈维氏弧菌SF-1 生长促进作用
4.1.7 重组蛋白YgjD对 VBNC状态哈维氏弧菌SF-1 的复苏作用
4.2 结果与分析
4.2.1 重组蛋白YgjD对革兰氏阴性细菌的促生长作用
4.2.2 重组蛋白YgjD对革兰氏阳性细菌的促生长作用
4.2.3 重组蛋白YgjD对低温培养的哈维氏弧菌SF-1 的促生长作用
4.2.4 YgjD及突变体蛋白对哈维氏弧菌SF-1 促生长作用
4.2.5 重组蛋白YgjD对 VBNC状态的哈维氏弧菌SF-1的复苏作用
4.3 讨论
结论
参考文献
致谢
附录 攻读学位期间所发表的学术论文目录
本文编号：3728014
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摘要
Abstract
第1章 绪论
1.1 哈维氏弧菌概述
1.2 细菌活的非可培养状态(VBNC)
1.2.1 VBNC状态细菌形成及其影响
1.2.2 VBNC状态细菌检测及其可培养化
1.2.3 复苏促进因子(Rpf)
1.3 糖蛋白酶Gcp与 YgjD蛋白简述
1.3.1 糖蛋白酶(Gcp)简述
1.3.2 YgjD蛋白简述
1.4 本课题研究意义及目的
第2章 哈维氏弧菌YgjD蛋白纯化、酶活与性质研究
2.1 材料与方法
2.1.1 菌株与质粒
2.1.2 培养基、试剂及仪器
2.1.3 哈维氏弧菌ygjD基因表达及蛋白纯化
2.1.4 SDS-PAGE电泳检测
2.1.5 蛋白质浓度测定
2.1.6 YgjD蛋白酶活性测定
2.1.7 YgjD蛋白酶活性影响因素
2.1.8 重组YgjD对牛血清白蛋白水解能力研究
2.1.9 SDS-PAGE技术分析YgjD与 YeaZ蛋白体外作用
2.1.10 酵母双杂交技术分析YgjD与 YeaZ蛋白体内作用
2.2 结果与分析
2.2.1 YgjD重组蛋白的纯化及SDS-PAGE鉴定
2.2.2 YgjD重组蛋白的酶活性
2.2.3 YgjD蛋白酶活性影响因素
2.2.4 YgjD重组蛋白对牛血清白蛋白水解作用
2.2.5 SDS-PAGE技术分析YgjD与 YeaZ蛋白体外作用
2.2.6 酵母双杂交技术分析YgjD与 YeaZ体内作用
2.3 讨论
第3章 ygjD基因定点突变体构建、表达及性质研究
3.1 材料与方法
3.1.1 菌株及质粒
3.1.2 主要试剂与仪器
3.1.3 ygjD基因突变构建
3.1.4 突变体表达质粒的酶切与序列鉴定
3.1.5 感受态细胞的制备
3.1.6 重组质粒的转化与抽提
3.1.7 YgjD突变蛋白表达与纯化
3.1.8 纯化的YgjD突变蛋白浓度测定
3.1.9 纯化的YgjD突变蛋白蛋白酶活性测定
3.2 结果与分析
3.2.1 YgjD突变蛋白表达及纯化
3.2.2 纯化的YgjD突变体蛋白的浓度
3.2.3 纯化的YgjD突变体蛋白酶活性
3.3 讨论
第4章 YgjD及突变蛋白的促生长和促复苏作用研究
4.1 材料与方法
4.1.1 菌株与培养基
4.1.2 主要试剂与仪器
4.1.3 重组蛋白YgjD对革兰氏阴性细菌的促生长作用
4.1.4 重组蛋白YgjD对革兰氏阳性细菌的促生长作用
4.1.5 低温条件下YgjD蛋白对哈维氏弧菌SF-1 的促生长作用
4.1.6 YgjD及突变蛋白对哈维氏弧菌SF-1 生长促进作用
4.1.7 重组蛋白YgjD对 VBNC状态哈维氏弧菌SF-1 的复苏作用
4.2 结果与分析
4.2.1 重组蛋白YgjD对革兰氏阴性细菌的促生长作用
4.2.2 重组蛋白YgjD对革兰氏阳性细菌的促生长作用
4.2.3 重组蛋白YgjD对低温培养的哈维氏弧菌SF-1 的促生长作用
4.2.4 YgjD及突变体蛋白对哈维氏弧菌SF-1 促生长作用
4.2.5 重组蛋白YgjD对 VBNC状态的哈维氏弧菌SF-1的复苏作用
4.3 讨论
结论
参考文献
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本文编号：3728014
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