陆地棉GhBASS5基因克隆与功能分析

发布时间：2023-01-08 15:57

　　盐胁迫会导致棉花生长发育迟缓,产量显著下降。植物排钠的机制有以下三种,降低钠离子内流转运蛋白等基因的表达,进入细胞的钠离子被运输和储存在液泡中,细胞质中的Na⁺可以通过质膜Na⁺/H⁺逆向转运体转运到外部介质或质外体。通过比对耐盐和敏盐棉花材料的转录组数据,我们发现在耐盐材料固有基因BASS5（胆汁酸:Na⁺共转运体,BASS是一类依赖Na⁺梯度共转运小分子酸的膜通道蛋白）的表达量显著低于敏盐棉花材料。BASS5是一个钠依赖型转运蛋白,但其在盐胁迫中的作用尚未有报道。为了研究该基因在棉花盐胁迫中的功能,本试验构建了GFP荧光定位载体,合成GhBASS5的抗体运用免疫荧光组织定位的方法,确定其亚细胞和亚组织定位,利用VIGS（Virus induced gene silencing）技术侵染棉花,得到GhBASS5基因沉默的棉花植株,模拟盐胁迫处理观察并统计幼苗生长期的生理生化实验以及运用NMT测定根部钠离子流。结果如下:1.从陆地棉品种“中棉所ZG-5”中克隆到目的基因:一个下... 

【文章页数】：76 页

【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
1 引言
    1.1 棉花耐盐性研究概况
        1.1.1 盐胁迫及其对棉花影响的范围
        1.1.2 高盐对棉花生长的影响
        1.1.3 盐胁迫制约棉花生长发育的机制
    1.2 植物耐盐研究
    1.3 BASS基因的研究进展
        1.3.1 BASS的研究现状
        1.3.2 BASS的蛋白结构
    1.4 质体在植物耐盐中的作用
    1.5 NMT的原理及研究现状
    1.6 本研究的目的及意义
2 GhBASS5基因的分子克隆与鉴定
    2.1 实验材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 菌株、质粒和载体
        2.1.3 溶液配制
        2.1.4 常用试剂及酶
        2.1.5 引物及测序
    2.2 实验方法
        2.2.1 棉花基因组DNA的提取及检测
        2.2.2 棉花基因组RNA的提取及反转录
        2.2.3 克隆棉花GhBASS5基因
        2.2.4 GhBASS5氨基酸同源序列比对分析以及进化树的构建
        2.2.5 GhBASS5基因的组织特征表达分析
        2.2.6 GhBASS5蛋白的亚细胞和亚组织定位
    2.3 结果分析
        2.3.1 棉花GhBASS5基因的克隆
        2.3.2 GhBASS5蛋白同源序列比对分析
        2.3.3 GhBASS5的氨基酸序列进化树的构建
        2.3.4 棉花GhBASS5基因的组织表达特征分析
        2.3.5 棉花GhBASS5蛋白的亚细胞定位
        2.3.6 棉花GhBASS5蛋白免疫荧光亚组织定位
    2.4 讨论
3 沉默GhBASS5基因提高陆地棉耐盐性
    3.1 实验材料
        3.1.1 植物材料
        3.1.2 菌株、质粒载体
        3.1.3 常用试剂及酶
        3.1.4 培养基,抗生素以及重悬液的配制
    3.2 实验方法
        3.2.1 含有目的基因片段的沉默载体VIGS-GhBASS5构建
        3.2.2 棉花VIGS体系的构建
        3.2.3 转化植株GhBASS5基因表达水平的检测
        3.2.4 沉默GhBASS5基因的陆地棉盐胁迫处理
        3.2.5 棉花叶片中叶绿素含量的测定
        3.2.6 棉花叶片中脯氨酸含量的测定
        3.2.7 棉花叶片中丙二醛含量的测定
        3.2.8 棉花叶片中可溶性糖的测定
        3.2.9 棉花叶片中超氧离子、过氧化氢含量和氧化物酶含量及其基因表达水平的测定
        3.2.10 棉花根中超氧离子、过氧化氢含量及过氧化物基因表达水平的测定
        3.2.11 BASS家族基因,耐盐相关基因和离子运输相关基因的表达量分析
    3.3 结果分析
        3.3.1 病毒诱导基因沉默载体的构建
        3.3.2 棉花GhBASS5基因沉默植株表型分析
        3.3.3 目标基因表达水平的检测
        3.3.4 盐胁迫对GhBASS5基因沉默的棉花表型的影响
        3.3.5 盐胁迫对棉花叶绿素含量的影响
        3.3.6 盐胁迫对棉花丙二醛含量的影响
        3.3.7 盐胁迫对棉花可溶性糖含量的影响
        3.3.8 盐胁迫下棉花脯氨酸含量的测定
        3.3.9 盐胁迫对棉花根部O_2~-和H_2O_2及过氧化物基因表达水平的影响
        3.3.10 盐胁迫对棉花叶片O_2~-和H_2O_2及过氧化物含量和基因表达水平的影响
        3.3.11 盐胁迫对BASS家族,胁迫响应和离子运输基因表达量的影响
    3.4 讨论
4 GhBASS5基因参与钠离子运输
    4.1 材料与方法
        4.1.1 植物材料
        4.1.2 菌株、质粒和载体
        4.1.3 实验试剂
    4.2 实验方法
        4.2.1 棉花中钠钾离子含量的测定
        4.2.2 棉花根,叶中Na~+,K~+含量随时间的变化
        4.2.3 SBFI测定棉花根部原生质体内的钠离子含量
        4.2.4 NMT测定棉花根部钠离子流量
    4.3 实验结果
        4.3.1 盐胁迫下棉花不同组织钠钾离子含量的测定
        4.3.2 GhBASS5参与Na~+在膜上运输
        4.3.3 NMT:沉默GhBASS5提高棉花根部对Na~+的泵出能力
    4.4 讨论
5 结论与展望
参考文献
附录一 本试验所用引物列表
附录二 实验所用主要仪器
个人简历
硕士期间发表学术论文与研究成果
致谢


【参考文献】：
期刊论文
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[2]Prediction of VIGS efficiency by the Sfold program and its reliability analysis in Gossypium hirsutum[J]. Xiaoyang Ge,Jie Wu,Chaojun Zhang,Qianhua Wang,Yuxia Hou,Zuoren Yang,Zhaoen Yang,Zhenzhen Xu,Ye Wang,Lili Lu,Xueyan Zhang,Jinping Hua,Fuguang Li.  Science Bulletin. 2016(07)
[3]酸度对火焰光度计测定食品中钾和钠的影响[J]. 陈嘉勋,王志强,张方圆,舒永红,杨金兰.  山东化工. 2016(01)
[4]棉花叶肉原生质体分离及目标基因瞬时表达体系的建立[J]. 李妮娜,丁林云,张志远,郭旺珍.  作物学报. 2014(02)
[5]非损伤微测技术——揭示生命的语言[J]. 杨明.  生命世界. 2012(12)
[6]植物耐盐相关基因及其耐盐机制研究进展[J]. 单雷,赵双宜,夏光敏.  分子植物育种. 2006(01)



本文编号：3728761