牦牛Tp53基因特征及其在早期IVF胚胎和不同发情时期卵巢中的表达

发布时间：2017-05-17 09:09

  本文关键词：牦牛Tp53基因特征及其在早期IVF胚胎和不同发情时期卵巢中的表达，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：本研究旨在研究Tp53(Tumor protein Tp53)基因在牦牛不同发情时期卵巢和早期不同发育时期体外受精胚胎中的表达情况及其与体外受精胚胎发育的关系。采集牦牛卵巢,收集牦牛A、B级卵母细胞,通过体外成熟培养及对成熟卵母细胞体外受精后进行培养。根据黄牛的基因序列设计5’到3’端特异性引物,采用RT-PCR、实时荧光定量PCR(quantitative Real-time PCR,RT-qPCR)和间接免疫荧光方法检测不同时期卵巢和体外受精胚胎发育过程中Tp53在基因和蛋白水平的表达动态,并对其基因结构等其他生物信息进行分析。研究结果表明:(1)Tp53主要存在于细胞核中,少量存在于细胞质中,其作用和DNA的损伤有关。(2)本研究首次成功克隆获得了全长为1287 bp的牦牛Tp53基因cDNA,并将该基因序列提交到了GenBank,KR185965。(3)同源性分析表明,牦牛Tp53基因与瘤牛的相应序列同源性最高,表明Tp53基因在进化中具有高度保守性。;牦牛Tp53蛋白同源建模形成一个由α螺旋环绕β折叠片的3D结构。(4)Tp53基因在不同时期卵巢中的表达情况与卵泡颗粒细胞的转化、凋亡及卵巢内分泌有关。从本研究可以看出,Tp53基因在牦牛体外受精早期胚胎和不同发情时期卵巢中均有表达,表明Tp53基因在生殖过程中有重要作用。Tp53的表达量与胚胎发育阻断的发生几率成正相关,其作用可能和DNA的损伤有关。在不同发情时期卵巢中Tp53的表达量出现差异可能是由于DNA损伤程度及内分泌等因素的不同所致。牦牛Tp53基因的成功克隆及生物信息学分析为该基因的进一步研究奠定了一定基础。
【关键词】：牦牛 体外受精 胚胎 卵巢 基因克隆 生物信息学 Tp53
【学位授予单位】：甘肃农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S823.85
【目录】：

• 摘要4-5
• SUMMARY5-10
• 第一部分 文献综述10-17
• 1 牦牛概况10-11
• 2 Tp53基因的研究进展11-12
• 2.1 Tp53基因的结构及活化方式11-12
• 2.2 Tp53基因的生物学功能12
• 3 卵母细胞体外成熟、体外受精、体外培养的研究进展12-13
• 4 不同发情时期卵巢特征13-14
• 4.1 红体期卵巢特征14
• 4.2 黄体期卵巢特征14
• 4.3 卵泡期卵巢特征14
• 5 实时荧光定量PCR（RT-q PCR）及其应用14-16
• 5.1 RT-q PCR体系的建立14-15
• 5.2 RT-q PCR的应用15-16
• 6 免疫荧光染色技术及其应用16-17
• 7 本研究的研究目的及意义17
• 第二部分 牦牛Tp53基因特征及其在早期IVF胚胎和不同发情时期卵巢中的表达17-46
• 实验一 肿瘤抑制蛋白Tp53在牦牛体外受精早期胚胎中的表达17-29
• 1 材料18-20
• 1.1 实验材料18
• 1.2 主要试剂18-19
• 1.3 主要仪器19-20
• 2 实验方法20-23
• 2.1 Tp53基因在牦牛早期体外受精胚胎中表达差异的测定20-23
• 2.1.1 牦牛卵母细胞的收集及卵母细胞体外成熟20
• 2.1.2 卵母细胞体外受精及胚胎体外培养20-21
• 2.1.3 各个时期胚胎总RNA的提取及合成c DNA21
• 2.1.4 PCR检测Tp53的表达21-22
• 2.1.5 RT-q PCR检测Tp53的表达22
• 2.1.6 间接免疫荧光染色及检测Tp53的表达22-23
• 2.1.7 数据分析23
• 3 结果23-27
• 3.1 体外受精胚胎在不同时期的发育23-24
• 3.2 Tp53基因在不同发育时期体外受精胚胎中的表达情况24-27
• 4 讨论27-29
• 5 结论29
• 实验二 牦牛Tp53基因 特征分析及其在不同发情时期卵巢中的表达29-46
• 1 材料30
• 1.1 实验材料30
• 1.2 主要试剂及主要仪器30
• 2 实验方法30-33
• 2.1 不同时期卵巢RNA的提取与反转录30
• 2.2 引物设计30-31
• 2.3 牦牛Tp53基因的扩增与克隆31-32
• 2.3.1 PCR产物胶回收及纯化31-32
• 2.3.2 连接32
• 2.3.3 转化32
• 2.3.4 阳性克隆PCR扩增鉴定及测序32
• 2.4 生物信息学分析32
• 2.5 Real-time PCR测定Tp53在牦牛不同发情时期卵巢中的表达情况32-33
• 3 结果与分析33-44
• 3.1 牦牛不同发情时期卵巢中Tp53基因的表达33
• 3.2 基因重组子鉴定33-34
• 3.3 Tp53序列的测定34
• 3.4 氨基酸序列分析34-38
• 3.4.1 Tp53的基本理化性质分析34-35
• 3.4.2 肿瘤抑制蛋白Tp53磷酸化位点的分析35-38
• 3.5 牦牛Tp53空间结构38-40
• 3.6 核苷酸进化树的建立及同源性比较40-42
• 3.7 Real-time PCR结果42-44
• 4 讨论44-45
• 5 结论45-46
• 参考文献46-52
• 附录52-57
• 附录1 各个时期胚胎总RNA的提取及合成c DNA52-54
• 附录2 两步法c DNA合成步骤54-55
• 附录3 PCR产物胶回收及纯化55-56
• 附录4 转化过程56-57
• 致谢57-58
• 作者简介58-59
• 导师简介59-61

【参考文献】

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本文编号：372974