橡胶转移酶HRT2基因转录因子的鉴定及分析

发布时间：2017-05-17 04:13

  本文关键词：橡胶转移酶HRT2基因转录因子的鉴定及分析，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：世界所需的天然橡胶主要来自巴西橡胶树。乳管是橡胶树中合成天然橡胶的一种特化的分泌组织,由乳管细胞构成。乳管细胞中的橡胶粒子是合成天然橡胶的细胞器。天然橡胶的生物合成是典型的植物类异戊二烯代谢途径,其中一个主要反应就是橡胶烃链的延伸。至今对橡胶烃延伸的生化机制还不清楚,但认为异戊烯基转移酶(橡胶转移酶)是不可缺少的。有证据表明,橡胶转移酶HRT2在天然橡胶合成中起重要作用,但对该酶的转录调节还了解不多。本研究拟鉴定橡胶转移酶HRT2基因的转录因子,为研究天然橡胶生物合成调控机制奠定基础。主要研究结果：(1)在橡胶合成效率存在明显差异的橡胶树品种热研8-79和PR107中,橡胶合成关键酶HbFDPS、HbSRPP、HbHRT2的基因表达也存在明显差异,其中HbHRT2基因表达量差异最大。(2)从热研8-79和PR107的胶乳比较转录组数据中筛选到一个差异基因片段,通过荧光定量PCR实验验证其在橡胶树品种热研8-79、PR107中存在差异性,在热研8-79中表达量约为PR107的1.7倍。(3)克隆了差异基因的全长cDNA序列,序列分析显示基因该片段cDNA全长1105bp,开放阅读框长714bp,编码237个氨基酸。氨基酸序列的第1～60位氨基酸含有MADS蛋白结构域,表明该基因属于MADS-box类蛋白,命名为HbMADS3-2,进化树分析表明该蛋白与麻风树、蓖麻的MADS蛋白同源性分别达到了80%、82%。(4)基因表达分析发现,HbMADS3-2在不同组织中表达存在差异：在胶乳中表达量最高,在花和叶中呈现微弱表达,在根、果、幼茎中不表达。茉莉酸上调HbMADS3-2基因表达,但乙烯处理除了在2h时上调其表达,在1-3d下调其表达。(5)生物信息学分析表明,HbHRT2基因和HbSRPP基因启动子含有MADS-box结合的CArG-box元件,HbFDPS基因启动子未鉴定到该元件。进一步构建了pGADT7-HbMAD3-2酵母单杂交载体,通过酵母点对点杂交实验鉴定到HbMADS3-2结合橡胶转移酶基因HRT2启动子,表明HbMADS3-2是橡胶转移酶基因HRT2的转录因子。(6)通过酵母双杂交实验筛选到与HblMYC3的互作蛋白HblMYC2,HblMYC2与已经鉴定到的橡胶转移酶基因HRT2的一个转录因子HbMYC序列一致,两者为同一基因。但是,通过酵母单杂点对点实验证明,HblMYC3不能与HbHRT2基因的启动子结合。结论：HRT2基因在橡胶合成效率高的橡胶树品种热研8-79中的表达量显著高橡胶合成效率低的橡胶树品种PR107。其转录受多种转录因子调节,除了HbEIN3-1外,还有HblMYC2、HblMYC3和HbMADS3-2。这些转录因子可能形成一个复合体,介导乙烯和茉莉酸信号途径对HRT2基因的精细转录调控。
【关键词】：巴西橡胶树 橡胶转移酶HRT2 酵母单杂交 HbMADS3-2 HblMYC3
【学位授予单位】：海南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S794.1
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-10
• 1. 前言10-21
• 1.1 天然橡胶的生物合成10-11
• 1.2 橡胶生物合成关键酶11-14
• 1.2.1 橡胶延伸因子(REF)和小橡胶粒子蛋白11-12
• 1.2.2 HMG-CoA还原酶(HMGR)12
• 1.2.3 法尼基焦磷酸合成酶12-13
• 1.2.4 橡胶转移酶13-14
• 1.2.4.1 橡胶树转移酶HRT2基因转录因子的研究进展14
• 1.3 茉莉酸的生物合成及生理功能14-15
• 1.3.1 茉莉酸对植物次生代谢途径的调控14
• 1.3.2 MYC转录因子14-15
• 1.4 植物MADS-box基因研究进展15-17
• 1.4.1 植物MADS-box的基因结构15-16
• 1.4.2 MADS-box蛋白的转录调控机制16
• 1.4.3 橡胶树中MADS蛋白的研究进展16-17
• 1.5 酵母杂交技术的研究进展17-19
• 1.5.1 酵母双杂交原理17
• 1.5.2 酵母双杂交应用17
• 1.5.3 酵母单杂交17-18
• 1.5.4 酵母单杂交的应用18-19
• 1.6 本研究的目的意义19-20
• 1.7 技术路线20-21
• 2. 方法21-38
• 2.1 植物材料21
• 2.2 载体、质粒和菌种21-22
• 2.3 酵母培养基22
• 2.4 其他试剂22
• 2.5 HbMADS3-2、HbFDPS、HbHRT2、HbSRPP在橡胶树热研8-79、PR107的基因表达22-26
• 2.5.1 样品的采集22
• 2.5.2 橡胶树总RNA的提取22-23
• 2.5.3 cDNA第一链的合成23-24
• 2.5.4 荧光定量PCR24-26
• 2.6 酵母单杂交表达载体pGADT7-HbMADS3-2的构建26-30
• 2.6.1 5'-RACE26-28
• 2.6.2 HbMADS3-2全长cDNA的克隆28-29
• 2.6.3 HbMADS3-2酵母单杂交表达载体的构建29-30
• 2.7 酵母单杂交点对点验证HbMADS3-2与HbHRT2、HbFDPS、HbSRPP之间的互作30-32
• 2.7.1 酵母Y187感受态的制备30-31
• 2.7.2 pGADT7-HbMADS3-2与HbHRT2、HbFDPS、HbSRPP共转化酵母感受态31-32
• 2.8 不同激素处理对HbMADS3-2基因表达影响32
• 2.8.1 材料的处理32
• 2.8.2 不同处理下HbMADS3-2的基因表达32
• 2.9 利用酵母双杂交筛选HblMYC3的互作蛋白32-37
• 2.9.1 pGBKT7-HblMYC3酵母双杂交载体的构建32-33
• 2.9.2 胶乳cDNA文库的构建33-35
• 2.9.3 诱饵载体pGBKT7-HblMYC3与胶乳cDNA文库双杂交35
• 2.9.4 诱饵载体pGBKT7-HblMYC3自激活作用的鉴定35
• 2.9.5 酵母菌阳性菌株的鉴定35-37
• 2.10 酵母单杂交点对点验证HblMYC3与橡胶转移酶基因HRT2启动子之间的互作37-38
• 2.10.1 酵母单杂交载体pGADT7-HblMYC3的构建37
• 2.10.2 双酶切、连接37
• 2.10.3 pGADT7-HblMYC3与pHis2.1-HRT2点对点酵母单杂交37-38
• 3. 结果38-51
• 3.1 HbMADS3-2酵母单杂表达载体的构建38-41
• 3.1.1 HbMADS3-2、HbFDPS、HbHRT2、HbSRPP在橡胶树热研8-79、PR107的基因表达38-39
• 3.1.2 5'RACE扩增39
• 3.1.3 HbMADS3-2全长cDNA的扩增39
• 3.1.4 HbMADS3-2的生物信息学分析39-41
• 3.1.5 HbMADS3-2分子进化树分析41
• 3.2 HbMADS3-2基因表达分析41-43
• 3.2.1 HbMADS3-2基因在不同组织中的表达分析41-42
• 3.2.2 不同激素处理对HbMADS3-2表达的影响42-43
• 3.3 酵母单杂点对点验证HbMADS3-2与HbHRT2、HbFDPS、HbSRPP之间的互作关系43-46
• 3.3.1 HbHRT2、HbFDPS、HbSRPP启动子元件分析43
• 3.3.2 pGADT7-HbMADS3-2酵母单杂表达载体的构建43
• 3.3.3 HbMADS3-2和HbHRT2、HbFDPS、HbSRPP点对点酵母单杂交43-46
• 3.4 酵母双杂筛选互作蛋白HblMYC346-49
• 3.4.1 重组pGBKT7-HblMYC3诱饵表达载体构建与验证46
• 3.4.2 重组质粒pGBKT7-HblMYC3自激活检测46-47
• 3.4.3 HbIMYC3酵母菌文库的筛选及侯选质粒的分离47-48
• 3.4.4 HbIMYC3酵母菌文库侯选蛋白的测序及分析48-49
• 3.5 酵母单杂点对点验证HblMYC3是否为HbHRT2转录因子49-51
• 3.5.1 酵母单杂表达载体pGADT7-HblMYC3的构建与验证49
• 3.5.2 HblMYC3、HbHbHRT2点对点酵母单杂交49-51
• 4. 讨论51-53
• 4.1 HbHRT2的差异表达可能与橡胶合成效率高低有关51
• 4.2 HbMADS3-2在乳管细胞中大量表达,而且受茉莉酸上调表达,可能与橡胶合成调控有关51-52
• 4.3 HbHRT2的转录受多个转录因子调节,这些转录因子可能形成一个复合体,介导乙烯和茉莉酸信号途径对天然橡胶生物合成的调节52-53
• 5. 结论53
• 6. 创新53
• 7. 后续研究53-54
• 参考文献54-63
• 附录63-68
• 致谢68

【参考文献】

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  本文关键词：橡胶转移酶HRT2基因转录因子的鉴定及分析，由笔耕文化传播整理发布。

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本文编号：372534