远志鲨烯环氧酶基因克隆及其转录组研究

发布时间：2023-01-12 18:58

　　目的通过远志鲨烯环氧酶基因克隆及其转录组研究,为远志的种质改良与皂苷类成分的生物合成提供借鉴。方法（1）采用RT-PCR和RACE技术对远志鲨烯环氧酶（SE）基因进行全长序列克隆,并对SE基因全长序列及其编码的氨基酸序列进行生物信息学分析;（2）采用RT-q PCR和HPLC技术分别测定远志不同部位（根、茎、叶）SE基因相对表达量及细叶远志皂苷含量,并进行统计学分析探究两者间的关系;（3）通过转录组测序,对远志转录本和基因层面数据进行结构与功能注释,并对远志三萜皂苷生物合成通路及三萜骨架修饰通路进行研究,筛选参与三萜代谢过程的关键酶基因。结果（1）克隆得到远志SE基因的c DNA全长序列为1652 bp,含28 bp5’UTR,37 bp 3’UTR和1587 bp ORF区,编码528个氨基酸蛋白,Gen Bank登录号为MG917041。BLAST比对分析结果显示远志SE基因序列与已登录的其他物种具有较高同源性。远志SE基因编码蛋白的相对分子量和理论等电点分别为57882.34 Da和8.77,该蛋白属于PLN02985（角鲨烯单加氧酶,即SE）和FAD-binding-3超家族,... 

【文章页数】：105 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
符号说明
前言
第一章 远志鲨烯环氧酶基因的克隆及序列分析研究
    材料与方法
        1 实验材料
            1.1 植物材料
            1.2 菌株和载体
            1.3 酶和试剂
            1.4 培养基类型
            1.5 仪器及设备
        2 实验方法
            2.1 远志根总RNA的提取
            2.2 cDNA第一链的合成
            2.3 引物设计与合成
            2.4 远志鲨烯环氧酶基因核心片段扩增
            2.5 远志鲨烯环氧酶基因5'RACE扩增
            2.6 远志鲨烯环氧酶基因3'RACE扩增
            2.7 远志鲨烯环氧酶基因cDNA全长扩增
            2.8 远志鲨烯环氧酶基因生物信息学分析
    结果与讨论
        1 远志总RNA的提取及质量检测
        2 远志鲨烯环氧酶基因核心片段扩增与分析
        3 远志鲨烯环氧酶基因5'RACE扩增与分析
        4 远志鲨烯环氧酶基因3'RACE扩增与分析
        5 远志鲨烯环氧酶基因全长序列拼接
        6 远志鲨烯环氧酶基因全长序列扩增与分析
        7 远志鲨烯环氧酶基因生物信息学分析
            7.1 ORF分析及BLAST分析
            7.2 蛋白基本理化性质及结构功能预测
            7.3 ClustalX多重序列比对及系统进化树分析
    小结
第二章 鲨烯环氧酶基因对细叶远志皂苷含量影响研究
    材料与方法
        1 实验材料
            1.1 植物材料
            1.2 酶和试剂
            1.3 仪器及设备
        2 实验方法
            2.1 细叶远志皂苷的含量测定
            2.2 远志SE基因的表达分析
            2.3 细叶远志皂苷含量与SE基因表达量相关分析
    结果与讨论
        1 方法学考察
            1.1 线性范围考察
            1.2 精密度试验
            1.3 稳定性试验
            1.4 重复性试验
            1.5 加样回收率试验
        2 细叶远志皂苷含量测定
        3 远志总RNA的提取及质量检测
        4 RT-qPCR熔解曲线与扩增曲线
            4.1 熔解曲线
            4.2 扩增曲线
        5 远志SE基因相对表达量
        6 细叶远志皂苷含量与SE基因表达量相关分析
    小结
第三章 基于转录组的远志皂苷生物合成关键酶基因挖掘研究
    材料与方法
        1 实验材料
            1.1 植物材料
            1.2 试剂
            1.3 仪器及设备
        2 实验方法
            2.1 远志总RNA的提取
            2.2 文库构建及Illumina测序
            2.3 denovo组装
            2.4 转录组的功能注释
    结果与讨论
        1 远志总RNA的提取及质量检测
        2 从头组装
        3 基因功能注释
            3.1 NR库注释
            3.2 GO注释
            3.3 COG注释
            3.4 KEGG注释
        4 三萜皂苷生物合成通路相关基因
    小结
第四章 总结
参考文献
文献综述
    综述参考文献
致谢
攻读学位期间发表的学术论文目录
个人简介
开题、中期及学位论文答辩委员组成


【参考文献】：
期刊论文
[1]转录组学在中药研究中的应用现状[J]. 高宁,刘博,杨德强,苏晓琳,王蒙,匡海学.  化学工程师. 2017(06)
[2]金铁锁鲨烯环氧酶基因的克隆与表达[J]. 李国栋,韩丽君,刘小莉,杨耀文,钱子刚.  中药材. 2016(10)
[3]远志的研究进展[J]. 张陶珍,荣巍巍,李清,毕开顺.  中草药. 2016(13)
[4]三萜皂苷的合成生物学研究进展[J]. 罗祖良,张凯伦,马小军,郭玉华.  中草药. 2016(10)
[5]基于基因克隆的远志鲨烯环氧酶（SE）蛋白结构及进化分析[J]. 毛福英,赵云生,万德光,陈新,邹玲,戴贵东.  时珍国医国药. 2015(07)
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[7]传统中药远志研究概述[J]. 刘超,马海英.  河北农业科学. 2014(05)
[8]中药高通量转录组研究进展[J]. 张召宝,侯林,潘晴,王绪敏,崔清华,田景振,马鲁豫.  中国中药杂志. 2014(09)
[9]利用细胞和基因工程技术提高植物三萜皂苷合成策略的研究进展[J]. 孙凤阳,胡盈,赵越,由香玲.  中草药. 2013(23)
[10]三萜皂苷合成生物学元件的初步开发:三七鲨烯环氧酶编码基因克隆及表达模式分析[J]. 牛云云,朱孝轩,罗红梅,孙超,黄林芳,陈士林.  药学学报. 2013(02)

博士论文
[1]远志中皂苷类免疫佐剂活性成分的分离及活性评价[D]. 孙红祥.浙江大学 2005
[2]远志属两种植物的（口山）酮类成分研究[D]. 林黎琳.中国协和医科大学 2005

硕士论文
[1]基于UPLC/Q-TOF MS代谢组学和DGE转录组学技术研究远志中三萜皂苷的生物合成规律[D]. 薛英.山西大学 2015
[2]三七、西洋参中三萜皂苷合成关键酶基因的克隆及表达模式分析[D]. 牛云云.北京协和医学院 2013
[3]龙牙楤木三萜皂苷生物合成关键酶基因的克隆及遗传转化[D]. 赵春彦.吉林大学 2012



本文编号：3730308