BAC介导转FSHa/b基因公猪的分子鉴定和生物安全评价

发布时间：2023-02-26 02:50

　　促卵泡素(FSH)是一种哺乳动物体内调控繁殖性能的重要激素。转基因小鼠模型表明FSH过表达可以提高雌性小鼠排卵数及产仔数。实验室与合作单位前期利用细菌人工染色体和体细胞核移植将二花脸猪FSH?/?基因转入美系大白猪体内,获得了67头F0代转基因公猪。本研究选择来源于同一供体细胞的2头F0代转基因公猪与美系大白母猪杂交扩繁,对F1代公猪进行了系统的分子鉴定和生物安全评价。产仔数统计结果显示,F0代转基因公猪与配美系大白母猪产仔性能正常。经PCR检测和拷贝数验证分析,F1代转基因猪的阳性率为50.31%,外源基因的遗传符合孟德尔定律,8-9个拷贝的外源FSH?基因和5-6个拷贝的外源FSH?基因以多拷贝串联形式整合到转基因猪的基因组中。实时荧光定量PCR显示,F1代转基因公猪的心、肝、脾、肾、脑、睾丸和附睾中FSH?mRNA总表达量显著高于半同胞非转基因公猪,这些组织中检测不到FSH?mRNA的表达。Western blot显示,F1代转基因公猪垂体中FSH?蛋白表达量显著高于半同胞非转基因公猪。放射性免疫分析表明,90和300日龄时F1代转基因公猪血清中FSH蛋白激素含量显著高于半同胞非...

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【学位级别】：博士

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摘要
Abstract
缩略语
第一章 文献综述
    1.1 促卵泡素
        1.1.1 促卵泡素的结构和性质
        1.1.2 促卵泡素合成分泌的调控
        1.1.3 促卵泡素的功能
        1.1.4 FSHb与产仔数的关系
        1.1.5 促卵泡素的应用
    1.2 细菌人工染色体
        1.2.1 细菌人工染色体的结构特点
        1.2.2 基于细菌人工染色体的转基因研究
    1.3 转基因动物制备技术
        1.3.1 原核显微注射法
        1.3.2 精子载体法
        1.3.3 逆转录病毒法
        1.3.4 转座子介导的基因转移法
        1.3.5 体细胞核移植法
        1.3.6 锌指核酸酶基因编辑技术
        1.3.7 转录激活因子样效应核酸酶基因编辑技术
        1.3.8 规律成簇间隔短回文重复序列/Cas系统基因编辑技术
    1.4 转基因动物的应用
        1.4.1 动物品种改良与培育
        1.4.2 异种器官移植
        1.4.3 生物反应器和生物医药
        1.4.4 人类疾病的动物模型
    1.5 转基因动物的生物安全研究
        1.5.1 转基因动物生物安全的定义和意义
        1.5.2 转基因动物的生物安全研究原则和分子特征检测技术
        1.5.3 转基因动物生物安全的内容
        1.5.4 国际转基因动物生物安全的管理现状
    1.6 本研究的目的和意义
第二章 研究正文
    2.1 引言
    2.2 材料与方法
        2.2.1 实验动物
        2.2.2 DNA的提取
            2.2.2.1 猪DNA及蚯蚓DNA提取
            2.2.2.2 猪肠道微生物DNA提取
            2.2.2.3 土壤微生物DNA提取
        2.2.3 RNA的提取
        2.2.4 c DNA的合成
        2.2.5 蛋白提取及定量
        2.2.6 外源基因PCR检测
        2.2.7 拷贝数检测
            2.2.7.1 构建GAPDH-FSHa和GAPDH-FSHb双基因同质粒载体
            2.2.7.2 绝对定量检测FSHa和FSHb基因的拷贝数
        2.2.8 基因表达分析（RT-q PCR）
        2.2.9 Western blot
        2.2.10 表型测定
        2.2.11 16S r RNA菌群高通量测序
        2.2.12 基因水平漂移检测
    2.3 实验结果
        2.3.1 转基因猪的PCR检测和拷贝数验证
        2.3.2 FSH基因的表达分析
        2.3.3 转基因公猪的繁殖性状分析
        2.3.4 转基因公猪的健康状况分析
        2.3.5 16S r RNA菌群高通量测序
        2.3.6 基因水平转移分析
    2.4 讨论
        2.4.1 FSHa/b转基因猪的分子鉴定
        2.4.2 FSHa/b转基因公猪的繁殖性能
        2.4.3 FSHa/b转基因猪的生物安全评价
    2.5 结论
    2.6 后期工作展望
参考文献
附录
    附录1 本研究中的引物序列
    附录2 在读期间发表论文
致谢



本文编号：3749661