长角血蜱孤雌生殖种群防御素基因克

发布时间：2023-03-07 17:25

　　长角血蜱(Haemaphysalis longicornis)是专性吸血的体外寄生虫,在自然界中存在两性生殖种群与孤雌生殖种群,可携带多种病原体而导致疾病,给人类健康和畜牧业生产带来极大危害。防御素(defensin)是一种抗微生物肽,在动植物中广泛存在,尤其在节肢动物中,由于缺乏适应性免疫反应,防御素在其先天免疫防御过程中发挥重要作用,可以有效对抗入侵的病原体。蜱作为专性吸血的特殊类群,同样具有防御素家族多肽以抵御微生物或病原体的侵袭。本研究以长角血蜱孤雌生殖种群为研究对象,利用Clontech建库试剂盒和3’RACE的方法构建cDNA文库,分子克隆得到三条防御素基因,分别命名为Hp-defensin-1、Hp-defensin-2和Hp-defensin-3。开放阅读框大小分别为225bp、210bp和237bp,编码氨基酸个数为74、69和78,成熟肽长度分别为38、37和46,等电点分别为9.69、8.33和9.50。通过对Hp-defensin-1进行原核表达及功能分析,结果表明,长角血蜱Hp-defensin-1与边缘革蜱(ACJ04433.1)同源性最高,为75.68%。...

【文章页数】：67 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第一章 文献综述
    1.1 引言
    1.2 孤雌生殖种群简介
    1.3 抗菌肽简介
    1.4 昆虫抗菌肽简介
    1.5 展望
第二章 长角血蜱孤雌种群防御素基因的分子克隆
    2.1 实验材料
        2.1.1 实验动物
        2.1.2 实验试剂及耗材
        2.1.3 实验仪器
    2.2 实验方法
        2.2.1 长角血蜱孤雌生殖种群总RNA的提取
        2.2.2 cDNA文库的构建
            2.2.2.1 建库试剂盒构建
            2.2.2.2 3’RACE反转获得cDNA
        2.2.3 抗菌肽基因的克隆
        2.2.4 抗菌肽基因的全长的扩增
    2.3 实验结果
        2.3.1 长角血蜱孤雌生殖种群总RNA的提取
        2.3.2 cDNA文库的构建
        2.3.3 抗菌肽基因的克隆
        2.3.4 抗菌肽基因的生物信息学分析
            2.3.4.1 基因序列分析
            2.3.4.2 Hp-defensin13 的系统发育树分析
            2.3.4.3 蛋白序列分析
    2.4 讨论
        2.4.1 抗菌肽基因的克隆
        2.4.2 抗菌肽的生物学分析
第三章 长角血蜱孤雌种群防御素基因的原核表达
    3.1 实验材料
        3.1.1 实验试剂及耗材
        3.1.2 实验仪器
    3.2 实验方法
        3.2.1 构建Defensin基因的原核表达载体
        3.2.2 重组质粒pET-32(a＋)- defensin的诱导表达
        3.2.3 重组蛋白的质谱鉴定
        3.2.4 重组蛋白诱导表达的条件优化
        3.2.5 重组蛋白的纯化
            3.2.5.1 重组蛋白的大量收集
            3.2.5.2 装柱准备
            3.2.5.3 蛋白上清的亲和层析
    3.3 实验结果
        3.3.1 构建Defensin基因的原核表达载体
        3.3.2 重组质粒pET-32(a＋)- defensin的诱导表达
        3.3.3 重组蛋白诱导表达的条件优化
        3.3.4 重组蛋白的纯化
    3.4 讨论
        3.4.1 原核表达载体的选择与构建
        3.4.2 蛋白诱导表达条件的优化与纯化
第四章 长角血蜱孤雌种群防御素的功能分析
    4.1 实验材料
        4.1.1 实验试剂及耗材
        4.1.2 实验仪器
    4.2 实验方法
        4.2.1 长角血蜱孤雌生殖种群防御素基因表达量的分析
            4.2.1.1 防御素基因在不同时期不同组织中的表达量
            4.2.1.2 防御素基因不同菌胁迫下的表达量
        4.2.2 抑菌活性的分析
        4.2.3 抗氧化的分析
        4.2.4 溶血活性的分析
    4.3 实验结果
        4.3.1 长角血蜱孤雌生殖种群防御素基因表达量的分析
        4.3.2 抑菌活性的分析
        4.3.3 抗氧化的分析
        4.3.4 溶血活性的分析
    4.4 讨论
        4.4.1 防御素基因的定量分析
        4.4.2 HP-defensin-1 重组蛋白的功能分析
参考文献
致谢
攻读学位期间取得的科研成果清单



本文编号：3757578