伯克霍尔德菌脂肪酶基因在大肠杆菌中的高效可溶性表达及酶学性质分析
发布时间：2023-03-16 18:04
本课题组前期从油污土壤中分离到一株脂肪酶高产菌株,经分子鉴定并命名为Burkholderia sp.ZYB002;克隆了脂肪酶编码基因lipA及其对应伴侣蛋白编码基因lipB;构建了重组表达菌株E.coli BL21(DE3)-pACYCDuet-lipA/lipB,实现了脂肪酶基因lipA的异源可溶性表达,但可溶性表达水平较低。为了进一步提高脂肪酶基因lipA在大肠杆菌中的可溶性表达水平,本研究对脂肪酶基因lipA的表达体系进行了一系列优化,筛选出合适的宿主菌、表达载体;并对其发酵工艺进行了优化,显著提高了lipA基因在E.coli体内的可溶性表达水平;分析纯化了该重组蛋白,并对其基本酶学性质进行了表征。具体实验结果如下:1.脂肪酶基因lipA表达体系的优化。lipA与lipB分别插入到不同表达载体上或同一表达载体的不同多克隆位点,组成共表达体系。发现pETDuet载体,且lipB插入到MCS1处、lipA插入到MCS2处形成的共表达体系最有利于lipA的可溶性共表达;E.coli Origami 2(DE3)菌株较,E.coli BL21(DE3)菌株lipA的可溶性表达水平高。2...
【文章页数】：94 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
中文摘要
Abstract
中文文摘
绪论
1 脂肪酶概述
1.1 脂肪酶来源
1.2 洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶研究现状及应用
2 蛋白质异源表达系统简介
2.1 原核生物蛋白异源表达系统
2.2 真核生物蛋白异源表达系统
3 提高目的蛋白在大肠杆菌中可溶性表达的策略
3.1 降低目的蛋白合成速度
3.2 优化培养基组分
3.3 融合表达
3.4 筛选可溶性突变体
3.5 筛选使用合适的大肠杆菌表达宿主菌
3.6 共表达非特异性分子伴侣
3.7 共表达特异性天然伴侣折叠酶
4 本课题的研究背景及意义、内容、技术路线
4.1 本课题的研究背景及意义
4.2 本课题的研究内容
4.3 本课题的研究技术路线
第一章 Burkholderia sp.脂肪酶编码基因lipA及其对应伴侣蛋白编码基因lipB共表达载体的构建
1 前言
2 实验材料
2.1 实验菌株及质粒
2.2 实验引物
2.3 实验试剂与酶
2.4 培养基及主要溶液的配置
2.5 实验设备
3 实验方法
3.1 E.coli DH5α感受态细胞的制备
3.2 Burkholderia sp. ZYB002脂肪酶基因及其伴侣蛋白基因克隆
3.3 质粒pETDuet-lipB2的构建
3.4 质粒pETDuet-lipA/lipB的构建
3.5 质粒pET28a-lipA的构建
3.6 质粒pET28a-lipB的构建
3.7 质粒pACYCDuet-lipA1的构建
3.8 质粒pACYCDuet-lipB1和pETDuet-liB1的构建
3.9 质粒pACYCDuet-lipB/lipA和pETDuet-lipB/lipA的构建
4 结果和分析
4.1 Burkholderia sp. ZYB002脂肪酶基因及其伴侣蛋白基因的克隆
4.2 质粒pETDuet-lipB2的构建
4.3 质粒pETDuet-lipA/lipB的构建
4.4 质粒pET28a-lipA的构建
4.5 质粒pET28a-lipB的构建
4.6 质粒pACYCDuet-lipA1的构建
4.7 质粒pACYCDuet-lipB1和pETDuet-lipB1的构建
4.8 质粒pACYCDuet-lipB/lipA和pETDuet-lipB/lipA的构建
5 小结与讨论
第二章 lipA/lipB共表达体系的筛选及其优化
1 前言
2 实验材料
2.1 实验菌株
2.2 实验试剂
2.3 培养基及主要溶液的配置
2.4 实验设备
3 实验方法
3.1 不同重组质粒组合分别共转化E.coli BL21 (DE3)和E. coli Origami 2(DE3)
3.2 脂肪酶LipA的诱导表达
3.3 菌体密度OD600值测定
3.4 脂肪酶LipA的酶活力测定
3.5 SDS-PAGE分析
3.6 不同重组表达菌株分别在20℃条件下的生长曲线的测定
3.7 诱导剂IPTG作用浓度的优化
4 结果和分析
4.1 各重组表达菌株分别在30℃和20℃发酵条件下的可溶性表达水平
4.2 SDS-PAGE分析
4.3 不同重组表达菌株分别在20℃条件下的生长曲线的测定
4.4 诱导剂IPTG作用浓度的优化
5 小结与讨论
第三章 Burkholderia sp. ZYB002脂肪酶LipA的分离纯化及其酶学性质分析
1 前言
2 实验材料
2.1 实验菌株及质粒
2.2 实验试剂
2.3 培养基及主要溶液的配置
2.4 实验设备
3 实验方法
3.1 脂肪酶LipA的诱导表达
3.2 脂肪酶LipA的分离纯化
3.3 纯化后的脂肪酶LipA酶活力测定
3.4 纯化后的脂肪酶LipA蛋白含量的测定
3.5 纯化后的重组脂肪酶LipA的酶学性质分析
4 结果和分析
4.1 重组脂肪酶LipA的纯化
4.2 重组脂肪酶LipA的酶学性质分析
5 小结与讨论
第四章 结论与后续工作
1 结论
2 后续工作
附录
参考文献
攻读学位期间承担的科研任务与主要成果
致谢
个人简历
本文编号：3763050
【文章页数】：94 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
中文摘要
Abstract
中文文摘
绪论
1 脂肪酶概述
1.1 脂肪酶来源
1.2 洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶研究现状及应用
2 蛋白质异源表达系统简介
2.1 原核生物蛋白异源表达系统
2.2 真核生物蛋白异源表达系统
3 提高目的蛋白在大肠杆菌中可溶性表达的策略
3.1 降低目的蛋白合成速度
3.2 优化培养基组分
3.3 融合表达
3.4 筛选可溶性突变体
3.5 筛选使用合适的大肠杆菌表达宿主菌
3.6 共表达非特异性分子伴侣
3.7 共表达特异性天然伴侣折叠酶
4 本课题的研究背景及意义、内容、技术路线
4.1 本课题的研究背景及意义
4.2 本课题的研究内容
4.3 本课题的研究技术路线
第一章 Burkholderia sp.脂肪酶编码基因lipA及其对应伴侣蛋白编码基因lipB共表达载体的构建
1 前言
2 实验材料
2.1 实验菌株及质粒
2.2 实验引物
2.3 实验试剂与酶
2.4 培养基及主要溶液的配置
2.5 实验设备
3 实验方法
3.1 E.coli DH5α感受态细胞的制备
3.2 Burkholderia sp. ZYB002脂肪酶基因及其伴侣蛋白基因克隆
3.3 质粒pETDuet-lipB2的构建
3.4 质粒pETDuet-lipA/lipB的构建
3.5 质粒pET28a-lipA的构建
3.6 质粒pET28a-lipB的构建
3.7 质粒pACYCDuet-lipA1的构建
3.8 质粒pACYCDuet-lipB1和pETDuet-liB1的构建
3.9 质粒pACYCDuet-lipB/lipA和pETDuet-lipB/lipA的构建
4 结果和分析
4.1 Burkholderia sp. ZYB002脂肪酶基因及其伴侣蛋白基因的克隆
4.2 质粒pETDuet-lipB2的构建
4.3 质粒pETDuet-lipA/lipB的构建
4.4 质粒pET28a-lipA的构建
4.5 质粒pET28a-lipB的构建
4.6 质粒pACYCDuet-lipA1的构建
4.7 质粒pACYCDuet-lipB1和pETDuet-lipB1的构建
4.8 质粒pACYCDuet-lipB/lipA和pETDuet-lipB/lipA的构建
5 小结与讨论
第二章 lipA/lipB共表达体系的筛选及其优化
1 前言
2 实验材料
2.1 实验菌株
2.2 实验试剂
2.3 培养基及主要溶液的配置
2.4 实验设备
3 实验方法
3.1 不同重组质粒组合分别共转化E.coli BL21 (DE3)和E. coli Origami 2(DE3)
3.2 脂肪酶LipA的诱导表达
3.3 菌体密度OD600值测定
3.4 脂肪酶LipA的酶活力测定
3.5 SDS-PAGE分析
3.6 不同重组表达菌株分别在20℃条件下的生长曲线的测定
3.7 诱导剂IPTG作用浓度的优化
4 结果和分析
4.1 各重组表达菌株分别在30℃和20℃发酵条件下的可溶性表达水平
4.2 SDS-PAGE分析
4.3 不同重组表达菌株分别在20℃条件下的生长曲线的测定
4.4 诱导剂IPTG作用浓度的优化
5 小结与讨论
第三章 Burkholderia sp. ZYB002脂肪酶LipA的分离纯化及其酶学性质分析
1 前言
2 实验材料
2.1 实验菌株及质粒
2.2 实验试剂
2.3 培养基及主要溶液的配置
2.4 实验设备
3 实验方法
3.1 脂肪酶LipA的诱导表达
3.2 脂肪酶LipA的分离纯化
3.3 纯化后的脂肪酶LipA酶活力测定
3.4 纯化后的脂肪酶LipA蛋白含量的测定
3.5 纯化后的重组脂肪酶LipA的酶学性质分析
4 结果和分析
4.1 重组脂肪酶LipA的纯化
4.2 重组脂肪酶LipA的酶学性质分析
5 小结与讨论
第四章 结论与后续工作
1 结论
2 后续工作
附录
参考文献
攻读学位期间承担的科研任务与主要成果
致谢
个人简历
本文编号：3763050
本文链接：https://www.wllwen.com/kejilunwen/jiyingongcheng/3763050.html
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