LAMA5在腭发育关键期表达变化及基因沉默体外干扰腭发育的研究

发布时间：2023-04-08 22:32

　　目的:前期抽取30名非综合型唇腭裂的患儿血样,通过全外显子测序等生物信息技术寻找非综合型唇腭裂可能候选致病基因,筛选出突变率最高LAMA5基因rs145192286位点。本研究依靠前期的实验基础,探究其LAMA5基因与非综合型唇腭裂之间的关系。观察层粘连蛋白-5(LAMA5)在小鼠胚胎腭器官发育融合过程中的时空表达变化,利用RNAi技术靶向干扰LAMA5基因,观察腭突融合情况,了解特异性抑制靶基因下对于胚胎腭突发育融合的影响。方法:1.用断颈脱位法在C57BL/6J孕鼠妊娠第12.5天(E12.5)、E13.5、E14.5、E15.0、E15.5处死,保留小鼠胎头,应用免疫组织化学染色和Western Blotting法定位、半定量检测LAMA5蛋白在不同胚胎发育时期在腭突中的表达。2.建立体外腭器官培养模型,设计抑制LAMA5基因表达尾部带有绿色荧光标记物的shRNA腺病毒载体,将其导入E13.5体外培养腭突组织中,培养48h后倒置荧光显微镜下观察腭突融合情况,运用实时荧光定量PCR和Western blotting技术从mRNA水平和蛋白质水平分别检测干扰后的基因LAMA5表达量变...

【文章页数】：52 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
abstract
引言
第一部分 LAMA5在小鼠胚胎腭突发育过程中的时空表达变化
    实验材料与方法
        1.实验材料
            1.1 研究对象
            1.2 主要实验仪器
            1.3 主要实验试剂
        2.实验方法
            2.1 实验样本获取
            2.2 免疫组化染色检测 LAMA5 在小鼠腭组织中的定位及表达量
            2.3 Western Blotting检测LAMA5 在小鼠腭突中的表达变化
            2.4 免疫组化评定标准
            2.5 统计分析
    实验结果
        3.1 不同时期胚胎腭突组织中LAMA5蛋白的免疫组化定位及表达量
        3.2 不同时期胚胎腭突组织中LAMA5 蛋白Western Blotting表达量
    讨论
第二部分 腺病毒载体诱导LAMA5基因抑制体外腭突培养的研究
    实验材料和方法
        1 LAMA5-sh RNA腺病毒载体构建流程及滴度测定
            1.1 实验材料
                1.1.1 实验仪器
                1.1.2 实验试剂
            1.2 实验方法
        2 体外旋转培养腭突及抑制LAMA5重组腺病毒转染鉴定
            2.1 实验材料
                2.1.1 实验对象
                2.1.2 实验设备
                2.1.3 实验试剂
            2.2 实验方法
                2.2.1 实验分组
                2.2.2 重组腺病毒载体转染腭突
                2.2.3 RT-PCR检测LAMA5的mRNA表达量
                2.2.4 Western Blotting检测LAMA-5的mRNA表达量
            2.3 数据分析
    实验结果
        3.1 荧光显微镜下观察腺病毒干扰后腭突融合情况
        3.2 实时定量PCR检测腺病毒干扰效率及LAMA5的mRNA表达量
        3.3 Western Blotting检测腺病毒干扰后LAMA5 蛋白表达量
    讨论
结论
参考文献
综述
    综述参考文献
攻读学位期间的研究成果
中英缩略词对照表
致谢



本文编号：3786590