大豆GmPIPs基因克隆及耐盐性功能鉴定研究

发布时间：2023-04-12 02:37

　　大豆(Glycine max L.)是我国重要的粮食及油料作物,而一些非生物胁迫会严重威胁到作物的正常生长,如:高盐、干旱等。水通道蛋白是重要的水分转运蛋白,许多研究表明其在植物抵御外界环境危害时起到重要作用。本研究首先通过生物信息学分析,鉴定大豆中所包含的水通道蛋白。随后,从大豆中克隆得到了部分GmPIPs基因。分析了种子萌发期耐盐性,并采用荧光定量的方法分析GmPIPs基因的组织表达差异及盐胁迫对GmPIPs基因在根、叶表达影响的变化趋势。通过将GmPIPs连接到酵母表达载体中,进行酿酒酵母INVScⅠ的转化。通过对转化酵母进行盐、干旱胁迫,以验证GmPIPs基因对酵母耐逆性的影响。主要研究结果如下:(1)通过对大豆蛋白鉴定分析,总共获得了66个大豆水通道蛋白,其中包括24个液泡膜内在蛋白(TIPs)、21个质膜内在蛋白(PIPs)、15个类NOD26膜蛋白(NIPs)、4个膜内在小分子碱性蛋白(SIPs)和2个未知内在蛋白(XIPs)。(2)经不同浓度盐胁迫处理,发现在低浓度时会对大豆萌发产生促进作用。随着浓度的增大,萌发受到阻碍,在200 mmol/L时两种大豆萌发指标差异明显...

【文章页数】：77 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
第一章 文献综述
    1 植物水分运输及机制
        1.1 水分在植物体中的传输途径
        1.2 植物水分运输的调控
            1.2.1 植物的气孔调节
            1.2.2 植物的渗透调节
            1.2.3 植物水容调节
            1.2.4 植物水通道蛋白调节
    2 水通道蛋白的功能及调控
        2.1 水通道蛋白的生理功能
            2.1.1 水通道蛋白的结构及分类
            2.1.2 水通道蛋白生理功能
        2.2 水通道蛋白研究进展
    3 本研究的目的意义及主要研究内容
    4 技术路线
第二章 GmPIPs基因克隆及生物信息学分析-9 -
    1 材料
        1.1 植物材料
        1.2 供试菌株和载体
        1.3 主要试剂
        1.4 主要设备仪器
    2 试验方法
        2.1 大豆水通道蛋白的生物信息学分析
            2.1.1 GmAQP基因家族鉴定-9 -
            2.1.2 系统进化分析与命名
            2.1.3 蛋白特征分析
            2.1.4 GmAQP内含子、外显子、基因组定位及顺式作用元件
            2.1.5 GmAQP蛋白的保守域分析
        2.2 植物总RNA的提取与检测
        2.3 GmPIPs基因的分子克隆
            2.3.1 cDNA第一链的合成
            2.3.2 GmPIPs基因的克隆及PCR产物的回收纯化
            2.3.3 GmPIPs基因片段的克隆
    3 结果与分析
        3.1 GmAQP家族鉴定、命名及进化分类
        3.2 GmAQP家族理化性质
        3.3 GmAQP家族基因结构、定位及顺式作用元件
        3.4 GmAQP蛋白的保守结构域
        3.5 RNA样品质量检测
        3.6 GmPIPs基因片段扩增
        3.7 阳性克隆的筛选与鉴定
    4 讨论
        4.1 GmAQP家族生物信息学鉴定
        4.2 GmPIPs基因片段的克隆
    5 小结
第三章 大豆种子萌发期耐盐性及盐胁迫表达分析
    1 材料
        1.1 植物材料
        1.2 主要试剂
        1.3 主要仪器设备
    2 试验方法
        2.1 种子萌发期耐盐性鉴定
            2.1.1 萌发期材料培养
            2.1.2 测定项目与方法
        2.2 盐胁迫表达分析
            2.2.1 材料的培养
            2.2.2 总RNA的提取与检测
            2.2.3 c DNA第一链的合成
            2.2.4 引物设计与内参基因确定
            2.2.5 最适退火温度(Tm)的选择
            2.2.6 荧光定量qPCR
            2.2.7 数据处理
    3 结果与分析
        3.1 不同盐浓度发芽指标差异显著性分析
        3.2 RNA样品质量检测
        3.3 荧光定量表达分析
            3.3.1 GmPIP1;5 基因的表达分析
            3.3.2 GmPIP1;6 基因的表达分析
            3.3.3 GmPIP1;7 基因的表达分析
            3.3.4 GmPIP2;1 基因的表达分析
            3.3.5 GmPIP2;3 基因的表达分析
            3.3.6 GmPIP2;7 基因的表达分析
            3.3.7 GmPIP2;8 基因的表达分析
            3.3.8 GmPIP2;10 基因的表达分析
    4 讨论
    5 小结
第四章 GmPIPs基因酵母表达载体的构建及功能验证
    1 材料
        1.1 菌株与载体
        1.2 主要试剂
        1.3 主要设备仪器
    2 试验方法
        2.1 酵母表达载体的构建
            2.1.1 培养基的制备
            2.1.2 引物设计
            2.1.3 pYES2 质粒的获取
            2.1.4 目的片段的获得
            2.1.5 目的片段与酵母表达载体的连接及转化
            2.1.6 重组质粒的筛选与酶切验证
            2.1.7 酵母转化
            2.1.8 转化酵母PCR检测
        2.2 重组酵母的基础生长对比与胁迫处理
            2.2.1 酵母基础生长对比
            2.2.2 重组酵母的Na Cl胁迫处理
            2.2.3 重组酵母的30%PEG胁迫
    3 结果与分析
        3.1 酵母表达载体的构建
            3.1.1 质粒载体的选择
            3.1.2 重组质粒的酶切验证
            3.1.3 转化酵母的PCR验证
        3.2 重组酵母的基础生长与逆境胁迫抗性鉴定
            3.2.1 INVScⅠ(pYES2-GmPIP1;5)的对比分析
            3.2.2 INVScⅠ(pYES2-GmPIP1;6)的对比分析
            3.2.3 INVScⅠ(pYES2-GmPIP1;7)的对比分析
            3.2.4 INVScⅠ(pYES2-GmPIP2;1)的对比分析
            3.2.5 INVScⅠ(pYES2-GmPIP2;3)的对比分析
            3.2.6 INVScⅠ(pYES2-GmPIP2;7)的对比分析
            3.2.7 INVScⅠ(pYES2-GmPIP2;8)的对比分析
            3.2.8 INVScⅠ(pYES2-GmPIP2;10)的对比分析
    4 讨论
    5 小结
全文总结
参考文献
Abstract
附录
致谢



本文编号：3790256