食源性病原菌多粘菌素耐药基因的耐药机制研究
发布时间：2023-04-25 00:23
近年来,随着抗生素在牲畜养殖和临床治疗中的大量使用,微生物的耐药问题逐渐受到了世界范围内食品安全和公共卫生领域的广泛关注,特别是碳青霉烯类抗生素耐药菌株的出现,直接导致了人们在面对多重耐药菌株时出现了“无药可用”的尴尬境地。在这样一种严峻的背景下,多肽类抗生素多粘菌素开始受到越来越多的关注,多粘菌素对于革兰氏阴性细菌具有杀菌和抑菌作用,特别是针对越来越频繁出现的碳青霉烯类多重耐药菌株。但是从2016年开始由质粒介导多粘菌素耐药基因mcr-1及其同源基因不断的被报道出来,使得多粘菌素这一防线受到严重威胁。因此,对mcr-1阳性菌株的耐药性和mcr-1及相关家族基因耐药机制的研究,对于多粘菌素耐药细菌的防控具有十分重要的意义。本论文主要从以下几个方面进行研究:mcr-1阳性耐药菌株的筛选及其耐药性分析;建立针对5个mcr家族基因的多重PCR检测方法,并且对该方法的特异性、敏感性进行验证;mcr-5基因相关工程菌株构建和其耐药机制研究。本论文的主要研究结果如下:(1)mcr-1基因阳性大肠杆菌筛选及其耐药性分析。从来自巴基斯坦费萨拉巴德区养鸡场肉鸡粪便中分离出8株多粘菌素耐药菌株,经过形态学...
【文章页数】：99 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
1 研究背景
1.1 食源性病原菌简介
1.2 多粘菌素的发现与应用
1.3 多粘菌素的抗菌机制
1.4 多粘菌素耐药机制的研究现状
1.4.1 脂多糖的修饰作用
1.4.2 多粘菌素的外排泵机制
1.4.3 生物膜机制
1.5 质粒介导的多粘菌素耐药基因mcr的研究现状
1.5.1 mcr-1基因的研究现状
1.5.2 mcr家族基因的研究现状
1.6 研究目的与意义
2 mcr-1基因阳性大肠杆菌筛选及其耐药性分析
2.1 前言
2.2 材料与设备
2.2.1 试验材料
2.2.2 试剂与药品
2.2.3 培养基及缓冲液的配置
2.2.4 仪器与设备
2.3 试验方法
2.3.1 样品采集及菌株分离
2.3.2 耐药菌株的生化及分子鉴定
2.3.3 耐药菌株的多粘菌素耐药水平检测
2.3.4 耐药菌株的mcr-1基因及质粒多样性检测
2.3.5 耐药菌株MLST分型检测
2.3.6 耐药菌株PK105基因组检测及序列组装
2.3.7 耐药菌株PK105的脂质A提取纯化及MALDI-TOF质谱分析
2.3.8 耐药菌株对其他抗生素耐药水平的初步检测
2.4 结果与分析
2.4.1 耐药菌株的鉴定结果
2.4.2 耐药菌株对多粘菌素的耐药性
2.4.3 耐药菌株的mcr-1基因鉴定及mcr-1质粒载体多样性
2.4.4 mcr-1阳性菌株的MLST分型及其流行性
2.4.5 mcr-1阳性菌株PK105的质粒基因组图谱
2.4.6 mcr-1阳性菌株PK105脂质A的化学修饰
2.4.7 mcr-1阳性菌株的广谱耐药性
2.5 小结
3 mcr家族基因的多重PCR检测方法的建立
3.1 前言
3.2 材料与设备
3.2.1 试验材料
3.2.2 试剂与药品
3.2.3 培养基及缓冲液的配置
3.2.4 仪器与设备
3.3 试验方法
3.3.1 引物设计
3.3.2 DNA模板制备
3.3.3 多重PCR反应体系设计
3.3.4 PCR产物测序
3.3.5 多重PCR反应体系特异性及敏感性检测
3.3.6 野生型菌株mcr基因的检测
3.4 结果与讨论
3.4.1 多重PCR产物序列鉴定结果
3.4.2 多重PCR反应体系的特异性及敏感性
3.4.3 多重PCR反应体系对野生菌株检测的有效性
3.5 小结
4 多粘菌素耐药基因mcr-5的耐药机理研究
4.1 前言
4.2 材料与设备
4.2.1 试验材料
4.2.2 试剂与药品
4.2.3 培养基及缓冲液的配置
4.2.4 仪器与设备
4.3 试验方法
4.3.1 mcr-5耐药功能菌株与蛋白表达菌株的克隆与构建
4.3.2 MCR-5 的蛋白结构预测
4.3.3 mcr-5功能位点突变菌株构建及耐药功能验证
4.3.4 MCR-5与MCR家族蛋白功能区域互换菌株构建及其耐药功能验证
4.3.5 磷酸乙醇胺转移酶MCR-5的蛋白表达、纯化及鉴定
4.3.6 磷酸乙醇胺转移酶MCR-5的体外酶活反应
4.3.7 mcr-5功能菌株活性氧的激光共聚焦显微镜观察及化学拯救试验
4.3.8 mcr-5的诱导表达对菌株生长状态的影响检测
4.3.9 不同mcr家族基因的MG1655菌株多粘菌素最小抑菌浓度检测
4.4 结果与讨论
4.4.1 mcr-5耐药功能菌株与蛋白表达菌株
4.4.2 MCR-5 蛋白结构预测结果
4.4.3 mcr-5功能位点突变菌株的耐药功能分析
4.4.4 mcr-5与其他mcr家族基因蛋白功能区域互换菌株的耐药功能分析
4.4.5 磷酸乙醇胺转移酶MCR-5的体外纯化与蛋白鉴定结果
4.4.6 磷酸乙醇胺转移酶MCR-5的体外酶活催化
4.4.7 由活性氧介导的多粘菌素杀菌途径
4.4.8 mcr-5耐药基因的表达对菌株生长的影响
4.4.9 不同mcr家族基因的多粘菌素耐药性
4.5 小结
5 结论、创新点与展望
5.1 结论
5.2 创新点
5.3 展望
致谢
参考文献
攻读学位期间发表的学术论文目录
本文编号：3800326
【文章页数】：99 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
1 研究背景
1.1 食源性病原菌简介
1.2 多粘菌素的发现与应用
1.3 多粘菌素的抗菌机制
1.4 多粘菌素耐药机制的研究现状
1.4.1 脂多糖的修饰作用
1.4.2 多粘菌素的外排泵机制
1.4.3 生物膜机制
1.5 质粒介导的多粘菌素耐药基因mcr的研究现状
1.5.1 mcr-1基因的研究现状
1.5.2 mcr家族基因的研究现状
1.6 研究目的与意义
2 mcr-1基因阳性大肠杆菌筛选及其耐药性分析
2.1 前言
2.2 材料与设备
2.2.1 试验材料
2.2.2 试剂与药品
2.2.3 培养基及缓冲液的配置
2.2.4 仪器与设备
2.3 试验方法
2.3.1 样品采集及菌株分离
2.3.2 耐药菌株的生化及分子鉴定
2.3.3 耐药菌株的多粘菌素耐药水平检测
2.3.4 耐药菌株的mcr-1基因及质粒多样性检测
2.3.5 耐药菌株MLST分型检测
2.3.6 耐药菌株PK105基因组检测及序列组装
2.3.7 耐药菌株PK105的脂质A提取纯化及MALDI-TOF质谱分析
2.3.8 耐药菌株对其他抗生素耐药水平的初步检测
2.4 结果与分析
2.4.1 耐药菌株的鉴定结果
2.4.2 耐药菌株对多粘菌素的耐药性
2.4.3 耐药菌株的mcr-1基因鉴定及mcr-1质粒载体多样性
2.4.4 mcr-1阳性菌株的MLST分型及其流行性
2.4.5 mcr-1阳性菌株PK105的质粒基因组图谱
2.4.6 mcr-1阳性菌株PK105脂质A的化学修饰
2.4.7 mcr-1阳性菌株的广谱耐药性
2.5 小结
3 mcr家族基因的多重PCR检测方法的建立
3.1 前言
3.2 材料与设备
3.2.1 试验材料
3.2.2 试剂与药品
3.2.3 培养基及缓冲液的配置
3.2.4 仪器与设备
3.3 试验方法
3.3.1 引物设计
3.3.2 DNA模板制备
3.3.3 多重PCR反应体系设计
3.3.4 PCR产物测序
3.3.5 多重PCR反应体系特异性及敏感性检测
3.3.6 野生型菌株mcr基因的检测
3.4 结果与讨论
3.4.1 多重PCR产物序列鉴定结果
3.4.2 多重PCR反应体系的特异性及敏感性
3.4.3 多重PCR反应体系对野生菌株检测的有效性
3.5 小结
4 多粘菌素耐药基因mcr-5的耐药机理研究
4.1 前言
4.2 材料与设备
4.2.1 试验材料
4.2.2 试剂与药品
4.2.3 培养基及缓冲液的配置
4.2.4 仪器与设备
4.3 试验方法
4.3.1 mcr-5耐药功能菌株与蛋白表达菌株的克隆与构建
4.3.2 MCR-5 的蛋白结构预测
4.3.3 mcr-5功能位点突变菌株构建及耐药功能验证
4.3.4 MCR-5与MCR家族蛋白功能区域互换菌株构建及其耐药功能验证
4.3.5 磷酸乙醇胺转移酶MCR-5的蛋白表达、纯化及鉴定
4.3.6 磷酸乙醇胺转移酶MCR-5的体外酶活反应
4.3.7 mcr-5功能菌株活性氧的激光共聚焦显微镜观察及化学拯救试验
4.3.8 mcr-5的诱导表达对菌株生长状态的影响检测
4.3.9 不同mcr家族基因的MG1655菌株多粘菌素最小抑菌浓度检测
4.4 结果与讨论
4.4.1 mcr-5耐药功能菌株与蛋白表达菌株
4.4.2 MCR-5 蛋白结构预测结果
4.4.3 mcr-5功能位点突变菌株的耐药功能分析
4.4.4 mcr-5与其他mcr家族基因蛋白功能区域互换菌株的耐药功能分析
4.4.5 磷酸乙醇胺转移酶MCR-5的体外纯化与蛋白鉴定结果
4.4.6 磷酸乙醇胺转移酶MCR-5的体外酶活催化
4.4.7 由活性氧介导的多粘菌素杀菌途径
4.4.8 mcr-5耐药基因的表达对菌株生长的影响
4.4.9 不同mcr家族基因的多粘菌素耐药性
4.5 小结
5 结论、创新点与展望
5.1 结论
5.2 创新点
5.3 展望
致谢
参考文献
攻读学位期间发表的学术论文目录
本文编号：3800326
本文链接：https://www.wllwen.com/kejilunwen/jiyingongcheng/3800326.html
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