Piezo基因敲除载体与抗ToMV病毒载体的构建及转化农杆菌

发布时间：2023-05-12 21:14

　　植物中存在Piezo基因,而且与动物中该基因同源性较高,推测其编码蛋白的功能也应与压力有关,但是目前该基因在植物上的功能尚无任何报道。因此,本文利用TRIzol法提取番茄幼嫩果实的总RNA,PCR扩增番茄Piezo基因片段,利用在线工具寻找靶点,通过Overlapping PCR技术以pYLsgRNA-AtU3b-LacZ质粒为模板构建完整的sgRNA表达盒片段,采用“金门”克隆法将sgRNA表达盒克隆到PYLCRISPR/CAS9Pubi-N表达载体上,构建Piezo基因敲除载体,并成功转化农杆菌,旨在探讨Piezo基因在植物上的功能。番茄花叶病毒(Tomato mosaic virus,ToMV)是一类世界性分布的植物病毒,西红柿是其主要寄主,侵染西红柿后使栽培面积大幅下降造成农业重大经济损失。最近研究发现CRISPR/Cas13a系统是一种能够靶向和切割基因组单链RNA(ssRNA)分子的2类VI-A型核糖核酸酶,可被开发利用到抗植物RNA病毒研究中。本研究根据西红柿密码子偏好性合成高GC含量的Cas13a,以PYLCRISPR/CAS9Pubi-N质粒为模板扩增Pubi启动子和...

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英文摘要
1 引言
    1.1 基因组编辑技术
        1.1.1 基因组编辑技术概述
        1.1.2 基因组编辑技术发展历程
        1.1.3 CRISPR/Cas与ZFN、TALEN比较
    1.2 CRISPR/Cas系统
        1.2.1 CRISPR/Cas系统基本结构
        1.2.2 CRISPR/Cas系统技术原理
    1.3 CRISPR/Cas系统在植物中的应用
        1.3.1 CRISPR/Cas9系统在植物中应用
            1.3.1.1 NHEJ介导的基因编辑
            1.3.1.2 HDR介导的基因定点插入或替换
        1.3.2 CRISPR/Cas13a系统在植物中的应用
            1.3.2.1 Cas13a与Cas9、Cpf1比较
            1.3.2.2 Cas13a与RNAi比较
    1.4 研究意义及主要研究内容
    1.5 创新点
    1.6 技术路线
2 CRISPR/Cas9基因敲除载体构建
    2.1 实验材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 实验试剂
        2.1.3 载体和引物
        2.1.4 常用培养基及抗生素的配制
    2.2 实验方法
        2.2.1 番茄幼苗叶片总RNA提取
        2.2.2 RT-PCR方法获取cDNA
        2.2.3 PCR扩增目标番茄基因片段
        2.2.4 sgRNA的设计
        2.2.5 sgRNA表达盒的构建
            2.2.5.1 PYLCRISPR/CAS9Pubi-N、pYLsgRNA-AtU3b/LacZ质粒提取
            2.2.5.2 构建sgRNA表达盒
            2.2.5.3 胶回收
        2.2.6 Cas9表达载体的构建
            2.2.6.1 Cas9质粒酶切
            2.2.6.2 酶切后回收
        2.2.7 CRISPR/Cas9基因敲除载体的构建
            2.2.7.1 将sgRNA表达盒克隆到PYLCRISPR/CAS9Pubi-N载体
            2.2.7.2 连接产物转化
            2.2.7.3 阳性重组质粒的筛选
    2.3 实验结果与分析
        2.3.1 番茄幼苗叶片总RNA提取
        2.3.2 番茄Piezo基因片段扩增
        2.3.3 载体质粒DNA的提取
        2.3.4 基因敲除靶位点的设计与合成
        2.3.5 Overlaping PCR构建sgRNA表达盒
        2.3.6 Cas9表达载体构建
        2.3.7 重组载体质粒的提取
        2.3.8 重组质粒引物扩增鉴定
    2.4 讨论
3 西红柿抗ToMV病毒载体构建
    3.1 实验材料
        3.1.1 菌株
        3.1.2 酶、实验试剂盒
        3.1.3 载体和引物
    3.2 实验方法
        3.2.1 合成西红柿密码子优化的的Cas13a
        3.2.2 Cas13a表达体系构建
            3.2.2.1 扩增Pubi启动子
            3.2.2.2 扩增Cas13a
            3.2.2.3 扩增终止子
            3.2.2.4 Cas13a表达体系各元件连接
        3.2.3 串联crRNA系统
            3.2.3.1 crRNA合成
            3.2.3.2 启动子的分析与获取
            3.2.3.3 PCR连接
        3.2.4 合适的植物表达体系元件
        3.2.5 各种质粒元件整合
            3.2.5.1 阳性克隆的鉴定
    3.3 实验结果与分析
        3.3.1 Pubi启动子与Cas13a的扩增
        3.3.2 Pubi启动子与Cas13a连接片段
        3.3.3 扩增终止子片段
        3.3.4 构建Cas13a表达体系
        3.3.5 扩增U3启动子与crRNA
        3.3.6 U3启动子与crRNA片段连接
        3.3.7 扩增合适的植物表达元件
        3.3.8 抗病毒载体质粒
    3.4 讨论
4 重组载体的转化
    4.1 实验材料
    4.2 实验方法
        4.2.1 农杆菌感受态细胞制备
        4.2.2 重组质粒转化农杆菌
        4.2.3 农杆菌转化子的筛选
    4.3 实验结果与分析
        4.3.1 Piezo基因敲除载体转化
        4.3.2 西红柿抗ToMV病毒载体转化
    4.4 讨论
5 结论与展望
    5.1 结论
        5.1.1 Piezo基因敲除载体构建
        5.1.2 西红柿抗ToMV病毒载体构建
        5.1.3 载体转化农杆菌
    5.2 展望
参考文献
附录
    附录1 文中所用引物
    附录2 主要仪器
    附录3 文中涉及的DNA序列
后记
攻读学位期间取得的科研成果清单



本文编号：3814646