蝗绿僵菌二肽酶基因MaPepD功能研究
发布时间：2023-05-19 02:13
蝗绿僵菌(Metarhizium acridum)是一类十分重要的模式真菌。在真菌中,肽酶在影响真菌适应性方面发挥着重要的作用,而二肽酶(dipeptidase)的功能研究仍然少见。二肽酶能够将二肽水解形成两个游离的氨基酸,对生物体糖代谢及氨基酸代谢具有十分重要的意义。目前,C69家族二肽酶dipeptidase(PepD)在真菌中功能尚未见报道。因此,本文以昆虫病原真菌蝗绿僵菌为研究对象,分析了其酶学特性,阐明了该二肽酶基因(MaPepD)在蝗绿僵菌中的功能,并对该基因参与调控相关表型的机制进行了探索。主要获得了以下研究结果:(1)大肠杆菌(Escherichia coli)表达获得MaPepD蛋白,该蛋白分子量为56-kDa,酶活性为240 U/mg,Km为1640 mM。该二肽酶最适pH 6.0最适温度是55°C。(2)缺失MaPepD基因后,分生孢子在1/4 SDAY培养基上萌发率提高,对紫外、湿热、细胞壁破坏剂抗性增加,但菌株毒力不受影响。(3)收集1/4 SDAY培养基上培养3 d的孢子进行RNA-Seq分析,结果表明:MaPepD可能介导了细胞壁合成...
【文章页数】：82 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
中文摘要
英文摘要
1 绪论
1.1 引言与研究背景
1.1.1 昆虫病原真菌及其研究进展
1.1.2 微循环产孢的研究进展
1.1.3 肽酶基因功能的研究进展
1.2 研究意义
1.3 研究目的
1.4 研究内容
1.5 技术路线
2 蝗绿僵菌二肽酶基因MaPepD功能研究
2.1 实验材料
2.1.1 实验菌株
2.1.2 质粒载体
2.1.3 主要实验试剂与试剂盒
2.1.4 主要培养基
2.1.5 实验溶液的配置
2.1.6 实验仪器
2.1.7 生物信息学分析网站及软件
2.2 实验方法
2.2.1 MaPepDcDNA阅读框全长的克隆
2.2.2 MaPepD基因生物信息学分析
2.2.3 试剂盒大量提取真菌基因组DNA
2.2.4 绿僵菌总RNA提取方法
2.2.5 大肠杆菌感受态细胞热转化
2.2.6 用试剂盒纯化回收PCR产物
2.2.7 MaPepD基因敲除及回复载体的构建
2.2.8 根癌农杆菌感受态AGL-1 的化学转化法
2.2.9 蝗绿僵菌与根癌农杆菌的遗传转化共培养
2.2.10 阳性转化子的筛选
2.2.11 Suthern bloting验证MaPepD敲除及回复菌株
2.2.12 产孢方式分析
2.2.13 SYA培养基上产孢量分析
2.2.14 分生孢子萌发量的分析
2.2.15 紫外湿热抗逆性分析
2.2.16 化学物质耐受性分析
2.2.17 真菌粗酶提取方法
2.2.18 蛋白浓度测定
2.2.19 原核表达及纯化
2.2.20 LC-MS定量分析氨基酸含量
2.2.21 蝗绿僵菌MaPepD粗酶活性测定
2.2.22 MaPepD酶活性测定
2.2.23 MaPepD最适p H及最适温度测定
2.2.24 MaPepD对二肽底物的动力学参数
2.2.25 外源添加氨基酸对产孢方式的影响
2.2.26 毒力实验分析
2.2.27 RNA-Seq分析MaPepD对产孢方式的影响
2.2.28 RNA-Seq分析MaPepD对抗逆性的影响
2.2.29 定量PCR验证
2.2.30 数据统计方法
2.3 实验结果与分析
2.3.1 MaPepD基因生物信息学分析
2.3.2 MaPepD酶学特性分析
2.3.3 MaPepD敲除及回复载体的构建
2.3.4 MaPepD基因对蝗绿僵菌产孢方式的影响
2.3.5 MaPepD基因调控蝗绿僵菌在SYA上产孢量及生长
2.3.6 MaPepD基因影响蝗绿僵菌生长及萌发率
2.3.7 MaPepD基因影响孢子的湿热、UV-B抗性
2.3.8 MaPepD基因影响蝗绿僵菌逆境耐受性
2.3.9 LC-MS检测氨基酸水平发生改变
2.3.10 ΔMa PepD二肽酶活性显著降低
2.3.11 外源添加β-Ala回复微循环产孢
2.3.12 敲除MaPepD后菌株毒力无影响
2.3.13 MaPepD调控蝗绿僵菌产孢模式转换的机制分析
2.3.14 MaPepD调控孢子抗逆性机制分析
2.4 讨论
3 主要结论及后续工作建议
3.1 本研究的主要结论
3.2 后续实验安排
参考文献
附录
A 作者在攻读硕士学位期间发表论文的目录
B 本研究所用引物序列
附表1 本研究所用载体构建引物序列
附表2 微循环产孢调控DGE结果
附表3 微循环产孢DEGs定量引物
附表4 分生孢子抗逆性DGE结果
附表5 孢子抗逆性DEGs定量引物
附表6 LC-MS氨基酸代谢组定量结果
附图1 QRSD分析
C MaPepD的cDNA序列
D 学位论文数据集
致谢
本文编号：3819455
【文章页数】：82 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
中文摘要
英文摘要
1 绪论
1.1 引言与研究背景
1.1.1 昆虫病原真菌及其研究进展
1.1.2 微循环产孢的研究进展
1.1.3 肽酶基因功能的研究进展
1.2 研究意义
1.3 研究目的
1.4 研究内容
1.5 技术路线
2 蝗绿僵菌二肽酶基因MaPepD功能研究
2.1 实验材料
2.1.1 实验菌株
2.1.2 质粒载体
2.1.3 主要实验试剂与试剂盒
2.1.4 主要培养基
2.1.5 实验溶液的配置
2.1.6 实验仪器
2.1.7 生物信息学分析网站及软件
2.2 实验方法
2.2.1 MaPepDcDNA阅读框全长的克隆
2.2.2 MaPepD基因生物信息学分析
2.2.3 试剂盒大量提取真菌基因组DNA
2.2.4 绿僵菌总RNA提取方法
2.2.5 大肠杆菌感受态细胞热转化
2.2.6 用试剂盒纯化回收PCR产物
2.2.7 MaPepD基因敲除及回复载体的构建
2.2.8 根癌农杆菌感受态AGL-1 的化学转化法
2.2.9 蝗绿僵菌与根癌农杆菌的遗传转化共培养
2.2.10 阳性转化子的筛选
2.2.11 Suthern bloting验证MaPepD敲除及回复菌株
2.2.12 产孢方式分析
2.2.13 SYA培养基上产孢量分析
2.2.14 分生孢子萌发量的分析
2.2.15 紫外湿热抗逆性分析
2.2.16 化学物质耐受性分析
2.2.17 真菌粗酶提取方法
2.2.18 蛋白浓度测定
2.2.19 原核表达及纯化
2.2.20 LC-MS定量分析氨基酸含量
2.2.21 蝗绿僵菌MaPepD粗酶活性测定
2.2.22 MaPepD酶活性测定
2.2.23 MaPepD最适p H及最适温度测定
2.2.24 MaPepD对二肽底物的动力学参数
2.2.25 外源添加氨基酸对产孢方式的影响
2.2.26 毒力实验分析
2.2.27 RNA-Seq分析MaPepD对产孢方式的影响
2.2.28 RNA-Seq分析MaPepD对抗逆性的影响
2.2.29 定量PCR验证
2.2.30 数据统计方法
2.3 实验结果与分析
2.3.1 MaPepD基因生物信息学分析
2.3.2 MaPepD酶学特性分析
2.3.3 MaPepD敲除及回复载体的构建
2.3.4 MaPepD基因对蝗绿僵菌产孢方式的影响
2.3.5 MaPepD基因调控蝗绿僵菌在SYA上产孢量及生长
2.3.6 MaPepD基因影响蝗绿僵菌生长及萌发率
2.3.7 MaPepD基因影响孢子的湿热、UV-B抗性
2.3.8 MaPepD基因影响蝗绿僵菌逆境耐受性
2.3.9 LC-MS检测氨基酸水平发生改变
2.3.10 ΔMa PepD二肽酶活性显著降低
2.3.11 外源添加β-Ala回复微循环产孢
2.3.12 敲除MaPepD后菌株毒力无影响
2.3.13 MaPepD调控蝗绿僵菌产孢模式转换的机制分析
2.3.14 MaPepD调控孢子抗逆性机制分析
2.4 讨论
3 主要结论及后续工作建议
3.1 本研究的主要结论
3.2 后续实验安排
参考文献
附录
A 作者在攻读硕士学位期间发表论文的目录
B 本研究所用引物序列
附表1 本研究所用载体构建引物序列
附表2 微循环产孢调控DGE结果
附表3 微循环产孢DEGs定量引物
附表4 分生孢子抗逆性DGE结果
附表5 孢子抗逆性DEGs定量引物
附表6 LC-MS氨基酸代谢组定量结果
附图1 QRSD分析
C MaPepD的cDNA序列
D 学位论文数据集
致谢
本文编号：3819455
本文链接：https://www.wllwen.com/kejilunwen/jiyingongcheng/3819455.html
最近更新
教材专著
