基于Red/ET同源重组的基因簇克
发布时间：2023-05-22 02:01
微生物是天然产物的重要来源,随着合成生物学的快速发展和基因组测序技术的进步,越来越多的微生物基因组测序工作已完成,人们在这些微生物基因组发现了大量的微生物次级代谢产物生物合成基因簇尚未被开发和研究,但是很多微生物很难进行遗传操作或者在实验室内无法培养。将基因簇转入遗传背景清晰、易操作的宿主菌进行异源表达是开发生物合成资源的一种重要手段。但是微生物次级代谢产物基因簇一般大于20 kb,很难通过PCR的方式获得。获得基因簇的传统方法是构建基因组文库,但是周期长、操作复杂,不能满足高通量克隆基因簇的要求。符军等于2012年根据RecE和RecT蛋白能高效介导线性DNA分子之间发生同源重组的特性,开发了能够将目的DNA片段从基因组直接捕获至载体上的直接克隆技术。目前RecET直接克隆技术已被广泛应用于次级代谢产物基因簇的异源表达研究。次级代谢产物在异源表达时经常需要对表达载体进行修饰以添加基因转移元件、插入正调控基因、敲除负调控基因等。基于酶切和连接的传统DNA重组方法由于受到酶切位点和DNA分子大小的限制,难以完成这些遗传修饰。张友明等于1998年利用大肠杆菌Redαβ蛋白能够高效介导线性D...
【文章页数】：158 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩略词中英文对照表
第1章 序论
1.1 天然产物的生物合成
1.1.1 聚酮合酶
1.1.2 非核糖体肽合成酶
1.2 DNA重组
1.2.1 Red/ET同源重组
1.2.2 位点特异性重组系统
1.2.3 转座重组系统
1.2.4 ccdB反向筛选系统
1.3 天然产物生物合成基因簇的挖掘与激活
1.3.1 原位激活生物合成基因簇
1.3.2 异源表达生物合成基因簇
1.3.3 插入启动子激活生物合成基因簇
1.3.4 宏基因中生物合成基因簇的研究进展
1.4 本课题开展思路与研究内容
第2章 构建生物合成基因簇克隆、修饰和异源表达的平台
2.1 引言
2.2 实验材料
2.2.1 本研究所用菌株和质粒
2.2.2 分子生物学试剂
2.2.3 寡核苷酸合成和DNA测序
2.2.4 DNA序列分析软件
2.2.5 仪器设备
2.3 细菌基因组的提取实验方法
2.3.1 Red/ET同源重组标准遗传操作程序
2.4 结果与分析
2.4.1 构建多功能、可控的大肠杆菌宿主
2.4.2 构建了标准化的直接克隆载体
2.4.3 构建标准化的链霉菌结合转移和整合元件
2.4.4 构建标准化的革兰氏阴性菌转移和转座元件
2.4.5 构建了标准化的革兰氏阴性菌广谱型复制子元件
2.5 本章讨论
2.5.1 Red/ET同源重组直接克隆和修饰基因簇的优越性与缺点
2.5.2 直接克隆载体的选择与制备
2.5.3 转座和结合转移元件的选择
2.5.4 直接克隆中遇到的问题及解决方法
第3章 波赛链霉菌ATCC 27952中基因簇直接克隆与异源表达
3.1 引言
3.2 实验材料
3.2.1 本研究所用菌株和质粒
3.2.2 分子生物学试剂
3.2.3 寡核苷酸合成和DNA测序
3.3 实验方法
3.3.1 波赛链霉菌ATCC 27952基因簇信息的分析
3.3.2 波赛链霉菌ATCC 27952基因组的提取与酶切
3.3.3 构建直接克隆载体
3.3.4 用RecET同源重组技术直接克隆Cluster7
3.3.5 利用Redαβ同源重组技术添加结合转移元件
3.3.6 利用Redαβ同源重组技术添加启动子
3.3.7 基因簇的接合转移
3.3.8 链霉菌重组子检测
3.3.9 链霉菌重组子的发酵
3.3.10 化合物的提取与HPLC-MS分析
3.4 结果与分析
3.4.1 基因簇的直接克隆与酶切鉴定
3.4.2 用Redαβ同源重组技术添加结合转移元件
3.4.3 利用Redαβ同源重组技术添加启动子
3.4.4 基因簇接合转移到链霉菌中进行的异源表达
3.4.5 化合物的提取与HPLC-MS分析
3.5 本章讨论
3.5.1 基因簇直接克隆和修饰
3.5.2 Cluster 7基因簇异源表达产物的分离纯化
第4章 ExoCET直接克隆技术的原理与应用
4.1 引言
4.2 实验材料
4.2.1 本研究所用菌株和质粒
4.2.2 分子生物学试剂
4.2.3 寡核苷酸合成和DNA测序
4.3 实验方法
4.3.1 ExoCET直接克隆原理的探索
4.3.2 基因簇的生物信息学分析
4.3.3 基因组的提取与酶切
4.3.4 大片段生物合成基因簇直接克隆载体的构建
4.3.5 大片段生物合成基因簇的直接克隆
4.3.6 生物合成基因簇的修饰、发酵与分析
4.4 结果与分析
4.4.1 联合体外退火和RecET重组促进DNA的重组
4.4.2 基因簇直接克隆载体的构建
4.4.3 细菌基因组的酶切
4.4.4 生物合成基因簇的直接克隆
4.4.5 基因簇添加结合转移元件
4.4.6 基因簇添加启动子
4.4.7 提取转化子的基因组进行PCR检测
4.5 本章讨论
4.5.1 基因簇的直接克隆、修饰与异源表达
4.5.2 ExoCET重组技术
第5章 联合体外退火和RecET同源重组系统从头合成基因簇
5.1 引言
5.2 实验材料
5.2.1 本研究所用菌株和质粒及其基因型和相关特征见表5-1
5.2.2 分子生物学试剂
5.2.3 寡核苷酸合成和DNA测序
5.3 实验方法
5.3.1 oligo重组模型的设计
5.3.2 Oligo的体外处理
5.3.3 Oligo重组线性载体的制备
5.3.4 细胞感受态的制备
5.3.5 菌落PCR鉴定oligo重组的片段大小
5.3.6 DNA测序检测oligo重组的片段序列是否正确
5.3.7 利用ExoCET进行DNA多片段的组装
5.4 结果与分析
5.4.1 RecET重组酶诱导多个oligo重组
5.4.2 RecET重组酶的拷贝数影响oligo重组的正确率
5.4.3 两步法合成Hemagglutinin基因(1683 bp)
5.4.4 三步法合成PatellamideA基因簇(12,689 bp)
5.5 本章讨论
5.5.1 RecET同源重组系统用于从头合成基因簇
5.5.2 影响Oligo重组的因素
第6章 研究结论与展望
6.1 成功构建了生物合成基因簇的直接克隆、修饰和异源表达的一体化工作平台
6.2 ExoCET重组技术极大提高了直接克隆大片段生物合成基因簇的效率
6.3 联合体外退火与RecET同源重组系统从头合成基因簇
6.4 未来的研究工作及展望
参考文献
致谢
攻读学位期间发表的学术论文和参加科研情况
附录
学位论文评阅及答辩情况表
本文编号：3821779
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【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩略词中英文对照表
第1章 序论
1.1 天然产物的生物合成
1.1.1 聚酮合酶
1.1.2 非核糖体肽合成酶
1.2 DNA重组
1.2.1 Red/ET同源重组
1.2.2 位点特异性重组系统
1.2.3 转座重组系统
1.2.4 ccdB反向筛选系统
1.3 天然产物生物合成基因簇的挖掘与激活
1.3.1 原位激活生物合成基因簇
1.3.2 异源表达生物合成基因簇
1.3.3 插入启动子激活生物合成基因簇
1.3.4 宏基因中生物合成基因簇的研究进展
1.4 本课题开展思路与研究内容
第2章 构建生物合成基因簇克隆、修饰和异源表达的平台
2.1 引言
2.2 实验材料
2.2.1 本研究所用菌株和质粒
2.2.2 分子生物学试剂
2.2.3 寡核苷酸合成和DNA测序
2.2.4 DNA序列分析软件
2.2.5 仪器设备
2.3 细菌基因组的提取实验方法
2.3.1 Red/ET同源重组标准遗传操作程序
2.4 结果与分析
2.4.1 构建多功能、可控的大肠杆菌宿主
2.4.2 构建了标准化的直接克隆载体
2.4.3 构建标准化的链霉菌结合转移和整合元件
2.4.4 构建标准化的革兰氏阴性菌转移和转座元件
2.4.5 构建了标准化的革兰氏阴性菌广谱型复制子元件
2.5 本章讨论
2.5.1 Red/ET同源重组直接克隆和修饰基因簇的优越性与缺点
2.5.2 直接克隆载体的选择与制备
2.5.3 转座和结合转移元件的选择
2.5.4 直接克隆中遇到的问题及解决方法
第3章 波赛链霉菌ATCC 27952中基因簇直接克隆与异源表达
3.1 引言
3.2 实验材料
3.2.1 本研究所用菌株和质粒
3.2.2 分子生物学试剂
3.2.3 寡核苷酸合成和DNA测序
3.3 实验方法
3.3.1 波赛链霉菌ATCC 27952基因簇信息的分析
3.3.2 波赛链霉菌ATCC 27952基因组的提取与酶切
3.3.3 构建直接克隆载体
3.3.4 用RecET同源重组技术直接克隆Cluster7
3.3.5 利用Redαβ同源重组技术添加结合转移元件
3.3.6 利用Redαβ同源重组技术添加启动子
3.3.7 基因簇的接合转移
3.3.8 链霉菌重组子检测
3.3.9 链霉菌重组子的发酵
3.3.10 化合物的提取与HPLC-MS分析
3.4 结果与分析
3.4.1 基因簇的直接克隆与酶切鉴定
3.4.2 用Redαβ同源重组技术添加结合转移元件
3.4.3 利用Redαβ同源重组技术添加启动子
3.4.4 基因簇接合转移到链霉菌中进行的异源表达
3.4.5 化合物的提取与HPLC-MS分析
3.5 本章讨论
3.5.1 基因簇直接克隆和修饰
3.5.2 Cluster 7基因簇异源表达产物的分离纯化
第4章 ExoCET直接克隆技术的原理与应用
4.1 引言
4.2 实验材料
4.2.1 本研究所用菌株和质粒
4.2.2 分子生物学试剂
4.2.3 寡核苷酸合成和DNA测序
4.3 实验方法
4.3.1 ExoCET直接克隆原理的探索
4.3.2 基因簇的生物信息学分析
4.3.3 基因组的提取与酶切
4.3.4 大片段生物合成基因簇直接克隆载体的构建
4.3.5 大片段生物合成基因簇的直接克隆
4.3.6 生物合成基因簇的修饰、发酵与分析
4.4 结果与分析
4.4.1 联合体外退火和RecET重组促进DNA的重组
4.4.2 基因簇直接克隆载体的构建
4.4.3 细菌基因组的酶切
4.4.4 生物合成基因簇的直接克隆
4.4.5 基因簇添加结合转移元件
4.4.6 基因簇添加启动子
4.4.7 提取转化子的基因组进行PCR检测
4.5 本章讨论
4.5.1 基因簇的直接克隆、修饰与异源表达
4.5.2 ExoCET重组技术
第5章 联合体外退火和RecET同源重组系统从头合成基因簇
5.1 引言
5.2 实验材料
5.2.1 本研究所用菌株和质粒及其基因型和相关特征见表5-1
5.2.2 分子生物学试剂
5.2.3 寡核苷酸合成和DNA测序
5.3 实验方法
5.3.1 oligo重组模型的设计
5.3.2 Oligo的体外处理
5.3.3 Oligo重组线性载体的制备
5.3.4 细胞感受态的制备
5.3.5 菌落PCR鉴定oligo重组的片段大小
5.3.6 DNA测序检测oligo重组的片段序列是否正确
5.3.7 利用ExoCET进行DNA多片段的组装
5.4 结果与分析
5.4.1 RecET重组酶诱导多个oligo重组
5.4.2 RecET重组酶的拷贝数影响oligo重组的正确率
5.4.3 两步法合成Hemagglutinin基因(1683 bp)
5.4.4 三步法合成PatellamideA基因簇(12,689 bp)
5.5 本章讨论
5.5.1 RecET同源重组系统用于从头合成基因簇
5.5.2 影响Oligo重组的因素
第6章 研究结论与展望
6.1 成功构建了生物合成基因簇的直接克隆、修饰和异源表达的一体化工作平台
6.2 ExoCET重组技术极大提高了直接克隆大片段生物合成基因簇的效率
6.3 联合体外退火与RecET同源重组系统从头合成基因簇
6.4 未来的研究工作及展望
参考文献
致谢
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附录
学位论文评阅及答辩情况表
本文编号：3821779
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