重组鲎素Ⅰ基因工程菌的构建表达及其生物学活性的研究

发布时间：2023-07-25 01:02

　　鲎素Ⅰ(TachyplesinsⅠ,TP-Ⅰ)是存在于东方鲎血细胞中的由17个氨基酸组成的小分子阳离子抗菌肽,结构内含2个二硫键,其二级结构为2个逆向平行的β-折叠通过1个β-转角结构连接。TP-Ⅰ具有强烈的抑杀细菌、真菌、病毒及肿瘤细胞等多种生物活性,被公认为是抗生素潜在替代药物,在医药、畜牧、食品添加剂以及培育农作物新品种等领域均有广阔的应用前景,但由于其获得途径受限制,导致目前并没有规模化TP-Ⅰ商业产品出现。为解决此类问题,本课题以串联TP-I基因为目的基因,利用基因工程技术构建高效表达TP-I的毕赤酵母(Pastoris pichia)真核表达体系,并且对表达产物进行各方面分析。首先,根据文献中已报道的TP-I肽氨基酸序列,分析TP-I多肽结构与其抑杀菌活性的关系、毕赤酵母菌对TP-I多肽的耐受情况等,选择具有17个氨基酸序列的TP-I肽作为目标序列。为实现选择的TP-I抗菌肽在工程菌中的高效表达,设计利用胰肽酶E的特异酶切位点-Ala↓或-Gly↓和羧肽酶A特异性酶切位点(序列C末端氨基酸),连接选定的4肽构成4拷贝串联74肽,根据毕赤酵母菌重组表达偏爱密码子原则,合成重组...

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【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
abstract
第1章 引言
    1 抗菌肽简介
    2 鲎素的研究情况
        2.1 鲎素分子结构和生物活性
        2.2 鲎素的作用机制
        2.3 鲎素的基因工程表达
        2.4 鲎素发展应用中存在的问题
        2.5 鲎素类肽的应用
    3 毕赤酵母菌的基因工程应用
        3.1 毕赤酵母真核表达系统简介
        3.2 毕赤酵母菌表达系统的应用
    4 课题研究的来源、目的及意义
        4.1 课题来源
        4.2 研究目的和意义
第2章 TP-Ⅰ基因序列设计及其重组构建
    1 实验材料
        1.1 质粒和菌株
        1.2 试剂
        1.3 仪器设备
        1.4 培养基和溶液配制
    2 实验方法
        2.1 大肠杆菌TOP 10F’感受态细胞的制备
        2.2 pGAPZαB质粒的转化与筛选
        2.3 pGAPZαB质粒的提取与鉴定
        2.4 限制性内切酶酶切反应
        2.5 酶切片段的胶分离回收
        2.6 4TP-Ⅰ与pGAPZαB的酶连反应
        2.7 重组质粒pGAPZαB-4TP-Ⅰ的转化与筛选
    3 结果与分析
        3.1 重组串联鲎素肽氨基酸序列设计
        3.2 重组串联TP-Ⅰ表达载体pGAPZαB-4TP-Ⅰ的构建
        3.3 目的基因测序结果
    4 小结
第3章 TP-Ⅰ毕赤酵母真核表达系统的构建
    1 实验材料
        1.1 质粒和菌株
        1.2 试剂
        1.3 仪器设备
        1.4 培养基和溶液配制
    2 实验方法
        2.1 工程菌GS115对化学合成TP-Ⅰ的耐受情况测定
        2.2 重组质粒pGAPZαB-4TP-Ⅰ的大量提取
        2.3 重组质粒pGAPZαB-4TP-Ⅰ的线性化与鉴定
        2.4 重组质粒pGAPZαB-4TP-Ⅰ的纯化与浓缩
        2.5 毕赤酵母菌GS115感受态细胞的制备
        2.6 毕赤酵母菌的电转化
        2.7 组成型阳性菌株的筛选
        2.8 毕赤酵母菌基因组DNA的提取
        2.9 插入重组质粒片段的PCR鉴定
        2.10 上清中表达产物的Tri-SDS-PAGE电泳
        2.11 高效表达鲎素菌株的筛选
    3 结果与分析
        3.1 工程菌GS115对化学合成TP-Ⅰ的耐受程度
        3.2 pGAPZαB-4TP-Ⅰ的线性化结果
        3.3 组成型阳性菌株的筛选结果
        3.4 插入重组质粒片段的PCR与测序结果
        3.5 高效表达重组串联鲎素肽菌株的筛选结果
    4 小结
第4章 重组TP-Ⅰ工程菌发酵产物分离纯化及生物活性分析
    1 实验材料
        1.1 质粒和菌株
        1.2 试剂
        1.3 仪器设备
        1.4 培养基和溶液配制
    2 实验方法
        2.1 工程菌GS115-GAPZαB-4TP-Ⅰ的生长曲线测定
        2.2 融合串联多肽6His-4TP-Ⅰ的Ni-IDA亲和层析柱纯化
        2.3 串联重组TP-Ⅰ的胰肽酶E酶解
        2.4 SephadexG-25填料去除胰肽酶E
        2.5 重组TP-Ⅰ单体的羧肽酶A酶解
        2.6 重组TP-Ⅰ单体含量测定
        2.7 重组TP-Ⅰ对各菌的抑菌实验
    3 结果与分析
        3.1 工程菌GS115-GAPZαB-4TP-Ⅰ生长曲线测定结果
        3.2 亲和层析纯化融合多肽6His-4TP-Ⅰ的Tri-SDS-PAGE电泳结果
        3.3 串联重组TP-Ⅰ的胰肽酶E酶解结果
        3.4 重组TP-Ⅰ单体含量测定结果
        3.5 重组TP-Ⅰ生物活性
    4 小结
第5章 研究结论与展望
    1 结论
    2 研究展望
致谢
参考文献
附录A：pGAPZαB-4TP-Ⅰ质粒测序图
附录B：重组GS115基因组PCR产物测序图
附录C：重组TP-Ⅰ单体的质谱分析结果
附录D：重组TP-Ⅰ单体的RP-HPLC分析结果
攻读学位期间的研究成果



本文编号：3836859